兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、目的：神經(jīng)細(xì)胞屬終末分化細(xì)胞，神經(jīng)系統(tǒng)受損傷后無法通過神經(jīng)細(xì)胞的再生而得以恢復(fù)。近幾年來，通過移植神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，已取得了一定的成果。但成人的神經(jīng)干細(xì)胞不易獲得，胚胎干細(xì)胞來源有限，且異體移植也容易產(chǎn)生排斥反應(yīng)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是存在于成年骨髓中的一種干細(xì)胞，具有多向分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下能分化成中胚層來源的間質(zhì)細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、

2、肌腱細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。近年的研究顯示，MSC的終末分化有可能跨越胚層界限，而向?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，如分化為心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。MSC易于獲得，擴增迅速，移植無免疫排斥反應(yīng)，可通過血腦屏障，提示MSC有望作為一種理想的種子細(xì)胞，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中發(fā)揮重要的作用。 應(yīng)用MSC進行細(xì)胞治療的關(guān)鍵因素，首先是要獲得較高純度的MSC進行體外擴增，其次是在體外定向誘導(dǎo)分化有較高的轉(zhuǎn)化率，這樣才能滿足細(xì)胞治療時所需的細(xì)胞數(shù)量。本

3、研究旨在探索一種分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的有效方法，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的進一步研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1 MSC的分離培養(yǎng)無菌條件下抽取6月齡雄性新西蘭白兔雙側(cè)髂骨骨髓，Perc01分離液(相對密度1.073)密度梯度離心，獲取骨髓單個核細(xì)胞進行培養(yǎng)，通過反復(fù)換液，傳代培養(yǎng)，得到相對純化的MSC。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化。繪制原代、2、5、8代細(xì)胞生長曲線。HE染色觀察細(xì)胞

4、形態(tài)。 2 體外誘導(dǎo)MSC分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞取體外培養(yǎng)擴增的3～6代MSC以1×10<'5>/ml的濃度接種于6孔培養(yǎng)板，采用含有1mmol/L β-巰基乙醇、10％胎牛血清的DMEMM培養(yǎng)液預(yù)誘導(dǎo)24h，再用含6mmol/L β-巰基乙醇的無血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)6h，倒置顯微鏡下密切觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞的形態(tài)改變，免疫組化測定誘導(dǎo)前后神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)情況，定量分析。 結(jié)果：

5、 1 細(xì)胞生長增殖及形態(tài)變化PerC01分離液分離后所獲細(xì)胞主要為圓形單個核細(xì)胞，其中混有少量的紅細(xì)胞，經(jīng)臺盼藍(lán)拒染法測定，活細(xì)胞的比例達(dá)95％以上。 原代細(xì)胞接種后見大量圓形細(xì)胞懸浮存在，輪廓清晰，24h后即有少量細(xì)胞貼壁，24h～48h貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞呈現(xiàn)類圓形或不規(guī)則形態(tài)，胞核質(zhì)分界清晰，折光性強。接種后3d～4d貼壁細(xì)胞明顯增多，8d～10d細(xì)胞呈集落生長，部分細(xì)胞開始拉長，伸出偽足變成短梭形或星形，向

6、周圍呈輻射狀排列，細(xì)胞核較大，胞漿中顆粒較多，呈圓形或橢圓形。12d后貼壁細(xì)胞呈長梭形外觀，部分區(qū)域融合成片。13d～14d細(xì)胞融合成單層，呈典型細(xì)長梭形外觀。但繼續(xù)培養(yǎng)后細(xì)胞可呈多層生長，無明顯接觸抑制現(xiàn)象。傳代細(xì)胞于傳代接種后12h貼壁，迅速生長，6d～8d爬滿瓶底。各代細(xì)胞形態(tài)基本一致，均為長梭形。 2 培養(yǎng)細(xì)胞的生長測定從原代細(xì)胞生長曲線上看出，原代培養(yǎng)時間潛伏期較長，一般為4d～5d，8d進入對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖明顯加

7、快，14d左右進入平臺期，細(xì)胞增殖速度趨于平緩。從2、5、8代細(xì)胞生長曲線上看出，傳代細(xì)胞生長潛伏期則只有1d～2d，3d～4d進入對數(shù)生長期，持續(xù)4d～5d，7d～8d進入平臺期。而且隨傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的增殖能力有所下降。 3 HE染色光鏡觀察MSC呈長梭形，多角形等，胞漿粉紅色，呈細(xì)網(wǎng)狀，細(xì)胞核深藍(lán)色，位于中央，可見分裂相。 4 體外誘導(dǎo)及免疫組化分析MSC經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)液(含1mmol/L β-巰基乙醇、10％胎

8、牛血清的DMEM培養(yǎng)液)預(yù)誘導(dǎo)24h后，倒置顯微鏡下觀察到長梭形細(xì)胞胞質(zhì)向胞核收縮，變?yōu)椴灰?guī)則形和圓形，少量細(xì)胞脫落死亡。加入誘導(dǎo)液(含6mmol/L β-巰基乙醇的無血清DMEM培養(yǎng)液)誘導(dǎo)后，細(xì)胞逐漸長出較長的突起，突起繼續(xù)延長出現(xiàn)一級分支和二級分支，而且折光性增強，呈現(xiàn)神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)。免疫組化分析誘導(dǎo)2h、6h后的神經(jīng)元樣細(xì)胞，NSE染色陽性，GFAP染色陰性，誘導(dǎo)6h后NSE染色陽性率為72.6±11.3％。誘導(dǎo)分化前的MSC