卵巢衰老體外細(xì)胞模型及抗苗勒管激素用于早期評估預(yù)警系統(tǒng)的建立.pdf

1、1小鼠卵巢竇前卵泡不同分離方法的比較
　　本研究的目的是探討小鼠竇前卵泡的最佳分離方法。取未成熟小鼠的卵巢,按照不同分離方法,單純機械法或酶解法分離竇前卵泡,并用基礎(chǔ)培養(yǎng)液進行培養(yǎng),比較不同分離方法獲得的卵泡數(shù)量、形態(tài),及對其早期生長發(fā)育的影響。其中2mg/ml的膠原酶可獲得大量基底膜完整的竇前卵泡及裸卵(P<0.01);體外培養(yǎng)2天后,酶解組卵泡生長直徑大(P<0.05)、GVBD率、放出第一極體率和7天生存率無明顯差異(P>0

2、.05)。由此可見膠原酶酶解法較單純機械法更易獲得大量高質(zhì)量竇前卵泡,且對其早期發(fā)育無明顯影響。
　　2小鼠卵巢顆粒細(xì)胞體外原代培養(yǎng)體系的建立
　　本研究的目的是探討基礎(chǔ)培養(yǎng)基、添加因子與血清相比,對乙烯雌酚(diethylstilbestrol, DES)處理的C57BL/6J未成年小鼠顆粒細(xì)胞(granulosa cells, GCs)增殖的影響,以建立一個無血清的體外原代培養(yǎng)體系,添加因子包括 ITS(為5 mg/ m

3、l胰島素,5 mg/ ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和5 g/ ml亞硒酸鈉的混合物),牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),丙酮酸鈉(sodium pyruvate,PNa)和表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF);此后,將此無血清培養(yǎng)體系用于評價這些添加因子對顆粒細(xì)胞甾體合成過程的影響以及相關(guān)的調(diào)節(jié)機制。DMEM/F12, McCoy’s5a, RPMI Medium1640, Medium

4、199, a-MEM被選為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,其中McCoy’s5a能有效的促進顆粒細(xì)胞的增殖(P<0.05)并且顆粒細(xì)胞貼壁及形態(tài)均較好。顆粒細(xì)胞在有血清的培養(yǎng)基中較無血清的生長狀態(tài)更佳; ITS,牛血清白蛋白,丙酮酸鈉和表皮生長因子在無血清狀態(tài)下對顆粒細(xì)胞增殖的促進能力逐漸增加,其中后三者在無血清的體系下?lián)碛信c血清相同的促顆粒細(xì)胞增殖能力。經(jīng)過2天得培養(yǎng),原代培養(yǎng)的細(xì)胞仍然為表達芳香化酶陽性的顆粒細(xì)胞,且維持正常的形態(tài),當(dāng)添加因子加入到無血

5、清的體系中時,這些細(xì)胞亦無凋亡的表現(xiàn)。在所有的添加因子中僅有 ITS能夠誘導(dǎo)雌二醇的產(chǎn)生,同時ITS、牛血清白蛋白和丙酮酸鈉能明顯的增加孕酮的分泌提示其能促進細(xì)胞的分化。這些添加因子的作用通過部分增加類固醇生成性急性期調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、3β羥類固醇脫氫酶(3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)、膽固醇側(cè)鏈裂解

6、酶(Cholesterol Side-Chain Cleavage Enzyme,P450scc)或芳香化酶(aromatase,P450arom)的轉(zhuǎn)錄水平達到。因此,McCoy’s5a培養(yǎng)基是一個較好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,ITS和丙酮酸鈉在無血清體系中同時促進原代顆粒細(xì)胞的增殖和分化,為顆粒細(xì)胞的生理學(xué)研究提供優(yōu)良的培養(yǎng)體系。
　　目的:闡明生殖衰老分期系統(tǒng)(the Stages of Reproductive Aging Works

7、hop stages, STRAW)中不同分期階段及不同年齡階段各種卵巢衰老相關(guān)指標(biāo)的變化,確定最佳反映卵巢衰老的指標(biāo)用于制定女性卵巢功能的參考值范圍,建立卵巢衰老的評價標(biāo)準(zhǔn);并通過區(qū)分生育年齡中期(mid reproductive age stage,MR)完善 STRAW分期。
　　實驗設(shè)計及方法:根據(jù) STRAW分期系統(tǒng)將18至74歲的健康女性進行分類,并檢測月經(jīng)第三天血清基礎(chǔ)卵泡刺激素(follicle-stimulati

8、ng hormone,FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E2)和抗苗勒管激素(anti-mullerian hormone,AMH)的水平以及卵泡期竇狀卵泡數(shù)(antral follicle counts, AFCs);記錄另一組女性中行 IVF治療的獲卵數(shù)及受孕結(jié)果。
　　結(jié)果:在生育年齡中期細(xì)分的情況下,隨著整個STRAW分期系統(tǒng)的推進,血清FSH, LH水平及F

9、SH/LH比值逐漸上升,血清 E2, AMH水平和AFCs逐漸下降(P<0.001)。血清 AMH(r=-0.679/-0.742)和AFCs(r=-0.620/-0.673)與 STRAW分期緊密相關(guān),且在25歲較早的時候就出現(xiàn)了明顯的下降( P<0.01),并和生育年齡中期階段的年齡緊密相關(guān)(r=-0.451,-0.445,)。因此 AMH和AFCs作為最佳卵巢衰老指標(biāo)制定參考值范圍;此外,0.982 ng/ml AMH和3個竇狀卵

10、泡數(shù)(生育年齡中期25-30歲的較低水平)可作為臨界值區(qū)分生育年齡中期為生育年齡早中期(early mid reproductive age,EMR)和生育年齡晚中期( late mid reproductive age,LMR)。EMR較 LMR女性可在 IVF中獲取更多的卵母細(xì)胞(P<0.05);雖無統(tǒng)計學(xué)差異,由 AMH水平區(qū)分的EMR相對于 LMR受孕率稍高(57.9％)。
　　結(jié)論:血清 AMH水平和AFCs早期就會出現(xiàn)

11、顯著的下降,可作為卵巢衰老較佳的指標(biāo)評價卵巢功能;并進一步區(qū)分和定義生育年齡中期,顯示了STRAW分期系統(tǒng)中年輕女性不同的卵巢衰老階段,為 IVF治療及生育計劃提供參考。
　　2卵巢衰老指標(biāo)用于預(yù)測絕經(jīng)年齡及構(gòu)建卵巢衰老預(yù)警系統(tǒng)
　　目的:絕經(jīng)年齡個體差異性較大。本研究的目的是利用數(shù)學(xué)模型的方法比較不同年齡相關(guān)的卵巢內(nèi)分泌和影像學(xué)指標(biāo)在正?？稍信灾蓄A(yù)測終末絕經(jīng)時間的能力(final menopause period,FMP

12、)并最終構(gòu)建卵巢衰老預(yù)警系統(tǒng)。
　　方法:我們檢測了358名正常健康可孕中國漢族女性的血清基礎(chǔ)抗苗勒管激素(anti-müllerian hormone, AMH),卵泡刺激素(follicular stimulating hormone, FSH)水平和竇狀卵泡數(shù)量(Antral follicle counts, AFCs),利用這些指標(biāo)與年齡構(gòu)建模型并找出最佳擬合效果的方程式。繼而通過最大似然估計的閾值方法計算出相應(yīng)樣本可能的

13、絕經(jīng)年齡,這些指標(biāo)預(yù)測FMP的能力由它們預(yù)測的絕經(jīng)年齡分布與實際的絕經(jīng)年齡分布的匹配度確定。最終,根據(jù)每位女性的實際指標(biāo)水平和年齡位于預(yù)測絕經(jīng)年齡分布的百分比區(qū)段位置預(yù)測絕經(jīng)年齡,達到預(yù)警目的。
　　結(jié)果: logAMH的二次回歸擬合, FSH的三次回歸擬合和AFCs的線性回歸分別最佳的反映了相應(yīng)指標(biāo)與年齡的關(guān)系(R2=0.634,0.595和0.320)。血清AMH的下降比 FSH的升高平均早4.5年,因此內(nèi)分泌學(xué)指標(biāo)中,AMH

14、被選為較佳的指標(biāo)與影像學(xué)指標(biāo)-AFCs相比預(yù)測絕經(jīng)年齡。由 AMH指標(biāo)模擬計算獲得的預(yù)測絕經(jīng)年齡分布與實際絕經(jīng)年齡分布在41歲到53歲間有較好的一致性,比AFCs的擬合效果更好。最終,二次方程擬合的AMH聯(lián)合實際年齡可以通過相應(yīng)的百分比區(qū)段位置預(yù)測絕經(jīng)年齡范圍。
　　結(jié)論:血清AMH水平是一個較FSH和AFCs更佳的指標(biāo)來預(yù)測女性個體的絕經(jīng)年齡,與實際年齡合并可預(yù)測終末絕經(jīng)時間,早期預(yù)示卵巢功能的下降。
　　第三部分綜述-卵

15、巢衰老評價與預(yù)測指標(biāo)的研究現(xiàn)狀
　　卵巢功能衰退引起的生育能力下降、圍絕經(jīng)期癥狀及老年性疾病嚴(yán)重影響和危害女性的身體健康及家庭幸福。因此,卵巢功能的評價及卵巢衰老的預(yù)測亦日益受到關(guān)注。隨著年齡的增長,卵泡數(shù)量及質(zhì)量不斷下降,卵巢功能隨之減退,最終發(fā)生衰老-絕經(jīng)。因此卵泡數(shù)與女性生育能力及內(nèi)分泌功能直接相關(guān),成為檢測卵巢功能的主要對象。目前關(guān)于卵巢衰老的檢測主要從卵巢功能的內(nèi)分泌學(xué)指標(biāo)、影像學(xué)指標(biāo)及組織學(xué)檢測等方面直接或間接地反應(yīng)卵