Rictor在肺癌細(xì)胞趨化運動和轉(zhuǎn)移中的功能研究.pdf

1、目的:
　　 Rictor是新近發(fā)現(xiàn)的蛋白,對其與mTOR復(fù)合所形成的mTORC2的功能目前研究甚少。趨化運動在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲中起重要作用。本研究將Rictor(mTORC2)與腫瘤細(xì)胞趨化運動相關(guān)聯(lián),應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)降低肺癌細(xì)胞中Rictor的表達水平,探討其對肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,初步明確Rictor在肺癌細(xì)胞趨化運動中的作用機制。同時,力求從中找到新的靶點,并有針對性的設(shè)計有效的抗癌藥物。
　　

2、方法:
　　 1.用免疫組化的方法檢測Rictor在肺癌組織中的表達情況,統(tǒng)計分析Rictor表達與各臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。
　　 2.應(yīng)用StealthTMRNA降低肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中Rictor蛋白的表達水平,用WesternBlotting技術(shù)驗證其表達。
　　 3.采用MTT和流式細(xì)胞儀檢測Rictor降表達對細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 4.用趨化運動實驗和劃痕實驗檢測Rict

3、or降表達對肺癌細(xì)胞的運動能力影響。
　　 5.用黏附實驗檢測Rictor降表達對肺癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間黏附能力的影響。
　　 6.用肌動蛋白聚合實驗檢測EGF刺激不同時間后Rictor降表達引起的肌動蛋白聚合的變化,采用磷酸化特異性抗體檢測Rictor降表達對EGF刺激后肌動蛋白結(jié)合蛋白cofilin磷酸化水平的影響。
　　 7.用WesternBlotting檢測Rictor降表達后其下游信號分子Akt的活

4、化程度。用免疫熒光的方法檢測Rictor與PKCζ在細(xì)胞中的定位情況,觀察在EGF刺激后,它們的分布變化；并用WesternBlotting方法檢測Rictor降表達對PKCζ活化程度的影響,進一步明確Rictor在調(diào)控肺癌細(xì)胞趨化運動中的分子機制。
　　 結(jié)果:
　　 1.Rictor在肺腺癌組織中高表達(陽性率55％),與患者年齡、性別、吸煙與否、TNM分期之間并無顯著的相關(guān)性,但與腫瘤患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P

5、<0.05)。
　　 2.Rictor表達陽性的患者預(yù)后不良,三年生存率僅為13.6％。
　　 3.應(yīng)用StealthTMRNA轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞后,Western檢測Rictor蛋白表達明顯下降。
　　 4.Rictor降表達減慢A549細(xì)胞的增殖(P<0.001),細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)在G1期細(xì)胞的比例升高。
　　 5.與對照組相比,Rictor降表達的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的趨化

6、運動能力比對照組細(xì)胞明顯減弱(P<0.001)。
　　 6.與對照組相比,Rictor降表達的A549細(xì)胞黏附能力減弱(P<0.001)。
　　 7.與對照組相比,Rictor降表達的A549細(xì)胞F-actin聚合減少；并且經(jīng)Western證實,降低Rictor表達能夠明顯減低與F-actin聚合和解聚相關(guān)蛋白cofilin的磷酸化水平。
　　 8.Rictor降表達阻斷Akt在Ser473位點的磷酸化；而且EG

7、F刺激后Rictor和PKCζ在細(xì)胞膜上出現(xiàn)共定位,降低Rictor表達減弱了PKCζ的活化程度。
　　 結(jié)論:
　　 1.Rictor在肺腺癌組織中過表達與患者發(fā)生早期轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)。
　　 2.Rictor參與調(diào)控了EGF誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的趨化運動和轉(zhuǎn)移。Rictor是通過調(diào)節(jié)cofilin的活化來調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞骨架重排的。
　　 3.Rictor是Akt和PKCζ的上游信號分子。Rictor是通過Akt/