肺癌細胞株中miRNA的篩選及miR-544a促進肺癌細胞轉移的機制研究.pdf

1、肺癌是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一。由于肺癌病人早期癥狀不典型,同時缺乏敏感的篩查指標及有效的早期確診方法,大多數(shù)患者就診時已經(jīng)處于疾病中晚期,錯過最佳治療時機。肺癌患者另一個預后不良的重要原因是容易復發(fā)和遠處轉移,即使早期患者在腫瘤完全切除的情況下也大多死于復發(fā)和轉移。因此進一步研究肺癌轉移的的分子機制,將有助于預防肺癌復發(fā)和轉移。miRNAs是一種新型腫瘤標記物。致癌類miRNAs通過下調抑癌基因的表達而促進腫瘤細胞的生長,抑癌

2、類miRNAs在轉錄后水平通過抑制原癌基因的表達而抑制腫瘤。深入研究miRNAs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用,將為肺癌的診斷和治療提供新的方案和新的靶點。
　　1.篩選差異表達的miRNAs
　　以兩株不同轉移能力的肺癌細胞株95C和95D為研究對象。提取總RNA后,利用miRNAs芯片對95C和95D的miRNA譜系分析篩選,獲得具有差異表達的 miRNAs。結果發(fā)現(xiàn)在95C和95D中,microRNAs表達存在差異:其中mi

3、R-544a、miR-320、miR-22、miR-103、miR-565和miR-23a等microRNAs,在高轉移肺癌細胞株95D中高表達;miR-135b、miR-455-5p、miR-196a、miR-448、miR-888、miR-193a-5p、miR-28-5p和 miR-139-5p等 microRNAs,在低轉移肺癌細胞株95C中高表達。
　　miRNA芯片檢測靈敏度較高,但存在一定的假陽性率。因此通過QPCR

4、對差異miRNA進行驗證,從而降低假陽性率。QPCR結果顯示,miR-544a在高轉移細胞株95D中的相對表達水平上調,其相對表達水平約是95C的3倍。該結果與芯片檢測結果一致。
　　2. miR-544a通過下調CDH1、上調Vimentin促進肺癌細胞的侵襲能力
　　利用TargetScans數(shù)據(jù)庫,檢索到miR-544a與CDH1、GSK-3β有高分數(shù)結合,提示CDH1、GSK-3β可能是miR-544a的靶基因。本實

5、驗進而采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)來加以驗證。在CDH1或GSK-3β野生型重組質粒中,與陰性對照組相比,轉染miR-544a mimic后,熒光強度比值明顯降低。結果表明CDH1、GSK-3β是miR-544a的靶基因。
　　進而采用細胞轉染的方法,將 miR-544a mimic轉染到低轉移肺癌細胞株95C中,進行Transwell侵襲實驗、劃痕實驗、Western blot等實驗檢測轉染細胞侵襲能力的變化以及CDH1、Viment

6、in等蛋白表達水平的變化。發(fā)現(xiàn)轉染細胞侵襲能力增強、CDH1下調、Vimentin上調。
　　3. miR-544a通過下調GSK-3β使肺癌細胞獲得腫瘤干細胞的特征
　　將miR-544a的序列克隆到pBaBe-puro載體中,構建了能表達成熟miR-544a的載體,進而轉染95C和95D,經(jīng)QPCR驗證:獲得了穩(wěn)定表達miR-544a的細胞系。進一步通過Western blot和腫瘤球懸浮培養(yǎng)實驗研究miR-544a與腫

7、瘤干細胞的關系。
　　Western blot實驗結果顯示,95C、95D轉染miR-544a后,GSK-3β表達降低,β-catenin和CD133表達增高。結合以上實驗結果,表明GSK-3β作為miR-544a的靶基因,受到miR-544a的抑制,導致GSK-3β下降;GSK-3β下降后,β-catenin的降解減少,其濃度升高,激活了Wnt/β-catenin信號通路,誘導腫瘤細胞侵襲、轉移,增殖能力增強。本實驗還發(fā)現(xiàn),95

8、C、95D轉染 miR-544a后,腫瘤干細胞標志CD133表達增高,轉染細胞能形成腫瘤球,說明轉染miR-544a的95C細胞具有了腫瘤干細胞的特征。
　　從以上實驗結果,得出結論如下:
　　1)miR-544a在肺癌高轉移細胞株95D中呈高表達。
　　2)CDH1、GSK-3β為miR-544a的靶基因。
　　3)miR-544a可以下調CDH1,誘導細胞發(fā)生EMT,促進細胞的侵襲和轉移。
　　4)mi