NDRG2在肝癌細(xì)胞與肝星形細(xì)胞相互作用中對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、研究背景:
　　上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、炎性細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成組織微環(huán)境，細(xì)胞間的相互作用可調(diào)控細(xì)胞的增值、分化、凋亡、分泌活化的可溶性因子及細(xì)胞外基質(zhì)組份，這些組份的協(xié)調(diào)使細(xì)胞和組織達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。但是在腫瘤微環(huán)境中[1]，這些細(xì)胞可以被腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)，在其周圍產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞趨化因子、基質(zhì)降解酶等，從而有利于腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。肝星型細(xì)胞（Hepatic stellate cell HSC）是

2、重要的肝基質(zhì)細(xì)胞，肝癌細(xì)胞可誘導(dǎo)HSC活化，而活化的HSC又可促進(jìn)肝細(xì)胞癌（Hepatic carcinoma HCC）的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。本研究擬了解肝癌細(xì)胞與HSC的相互作用對(duì)HCC轉(zhuǎn)移的影響。
　　NDRG2屬于NDRG家族，被定義為抑癌候選基因的它可在許多正常組織中表達(dá)。最近的許多研究表明NDRG2除了能抑制腫瘤增值，增加細(xì)胞凋亡外,還能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。有研究表明NDRG2表達(dá)缺失可引起HCC具有高轉(zhuǎn)移潛力和不良預(yù)后，針對(duì)100例

3、肝癌患者的免疫組化提示NDRG2降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、門靜脈栓塞、腫瘤浸潤(rùn)生長(zhǎng)方式及腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，將肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染NDRG2后可明顯抑制其浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移能力。NDRG2過(guò)表達(dá)可抑制由TGF-β1引起的肝癌細(xì)胞MMP-2及PAI-1表達(dá)的增加，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。乳腺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)NDRG2可誘導(dǎo)BMP4抑制MMP9表達(dá)，從而使乳腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力下降。另外在侵襲性腦膜瘤、黑色素瘤和大腸癌鼠模型中亦發(fā)現(xiàn)NDRG2能夠抑制腫瘤轉(zhuǎn)移

4、。HCC引起高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移的特性一直是腫瘤治療的難點(diǎn)，NDRG2在其轉(zhuǎn)移中的機(jī)制研究十分重要。
　　已有文獻(xiàn)提示NDRG2與MMPs間具有一定相關(guān)性，這引起我們對(duì)NDRG2是否參與了分泌MMPs的重要間質(zhì)細(xì)胞HSC活化的興趣。
　　CD44是細(xì)胞膜上廣泛表達(dá)的糖蛋白，在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間作用、淋巴細(xì)胞歸巢以及腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。CD44與透明質(zhì)酸（hyaluronic acid HA）結(jié)合可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)信號(hào)。通

5、過(guò)有效手段抑制CD44可降低腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。CD24是與P選擇素結(jié)合的粘附分子與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)，CD24通過(guò)活化alpha3beta1和alpha4beta1整合素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增值及增強(qiáng)對(duì)纖連蛋白、I和IV型膠原、層粘連蛋白的粘附，CD24表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞快速播散、運(yùn)動(dòng)及侵襲。同時(shí)HSC活化也會(huì)引起粘附分子的表達(dá)變化，所以我們也想進(jìn)一步明確NDRG2是否參與對(duì)肝癌細(xì)胞及HSC的粘附分子表達(dá)調(diào)控。
　　目的和內(nèi)容：研究N

6、DRG2與HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)粘附分子間的作用損傷，研究NDRG2是否參與HSC的相關(guān)活化基因調(diào)節(jié)和對(duì)粘附分子的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)一步了解NDRG2是否也參與了HSC的活化與肝癌細(xì)胞間的相互作用及對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的影響。
　　方法：
　　1）運(yùn)用RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系的NDRG2表達(dá)；通過(guò)劃痕、侵襲、粘附實(shí)驗(yàn)觀察不同轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞系的遷移、侵襲、粘附能力；運(yùn)用NDRG2基因的重組腺病毒及siRNA感

7、染和轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系使NDRG2過(guò)表達(dá)或下調(diào)后，觀察細(xì)胞遷移、侵襲、粘附能力的改變。
　　2）運(yùn)用NDRG2基因的重組腺病毒及siRNA感染和轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，通過(guò)Real Time PCR觀察轉(zhuǎn)移相關(guān)粘附分子的改變，進(jìn)一步通過(guò)Weatern blot檢測(cè)蛋白水平的改變。
　　3）繼續(xù)運(yùn)用NDRG2基因的重組腺病毒及siRNA感染和轉(zhuǎn)染肝星形細(xì)胞系LX2后，通過(guò)Real Time PCR觀察HSC活化相關(guān)分子的改變，進(jìn)一步通過(guò)W

8、eatern blot檢測(cè)蛋白水平的改變。
　　4）建立體外肝癌細(xì)胞與HSC的膠內(nèi)共培養(yǎng)模型和裸鼠荷瘤三維共培養(yǎng)模型，給予NDRG2干擾后，通過(guò)HE染色及免疫組化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察兩細(xì)胞間的粘附、趨化性及相應(yīng)基因的改變。
　　結(jié)果：
　　1）NDRG2隨肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)而減弱，細(xì)胞遷移、侵襲、粘附能力隨NDRG2表達(dá)增高而減弱，進(jìn)一步過(guò)表達(dá)NDRG2可觀察到細(xì)胞遷移、侵襲、粘附能力的減弱，下調(diào)NDRG2可觀察到細(xì)胞

9、遷移、侵襲、粘附能力的增強(qiáng)。
　　2）過(guò)表達(dá)NDRG2可觀察到粘附分子CD44、CD24在mRNA及蛋白水平的表達(dá)減弱；下調(diào)NDRG2可觀察到粘附分子CD44、CD24在mRNA及蛋白水平的增強(qiáng)；在肝癌患者癌組織病理切片免疫組化也提示NDRG2減低及CD44和CD24表達(dá)增高。
　　3）HSC中NDRG2過(guò)表達(dá)后，HSC活化相關(guān)基因α-SMA、CD44在mRNA及蛋白水平表達(dá)減弱，同時(shí)細(xì)胞的侵襲能力減弱；下調(diào)HSC上的NDR

10、G2表達(dá)可使α-SMA、CD44表達(dá)增加。
　　4）通過(guò)肝癌細(xì)胞和HSC的共培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)NDRG2后減弱了它們對(duì)HSC的趨化、粘附；下調(diào)肝癌細(xì)胞上的NDRG2增加了它們對(duì)HSC的趨化、粘附。過(guò)表達(dá)HSC上的NDRG2使得α-SMA、CD44表達(dá)減弱；同時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NDRG2可使TGF-β1作用HSC后增加的CD44的配體透明質(zhì)酸含量降低。
　　結(jié)論：在HCC微環(huán)境中NDRG2具有重要的調(diào)節(jié)作用，NDRG2的過(guò)