中藥復方對兔睪丸間質細胞的作用研究.pdf

1、補腎壯陽類中藥是我國醫(yī)學寶庫的重要組成部分。傳統(tǒng)的壯陽類中藥大多具有性激素或促性腺激素樣作用，雄激素可提高性中樞的興奮性，從而誘發(fā)性欲沖動，并維持正常的性機能。鑒于睪丸間質細胞(Leydig細胞)是雄性機體分泌睪酮的主要細胞，分泌量約占身體總睪酮的95％；國際上將對男性生殖疾病治療的研究重點集中在Leydig細胞的培養(yǎng)和移植上。目前，主要對Leydig細胞的體外生長和激素調控進行研究，而補腎壯陽類中藥對其影響的研究報道較少，特別是關于中

2、草藥復方提取物有效活性成分對Leydig細胞的直接作用的研究，未見相關報道。 本研究篩選出對兔精液品質等指標有顯著改善效果的中藥復方，精制后分別對公兔體內和體外的睪丸間質細胞進行研究，試驗內容主要包括如下5個方面。 1.篩選出一種對兔精液品質和性反應時間改善效果較好的中藥復方和提取溶劑。試驗用純水和70％的乙醇分別對四個復方進行提取，制成八種提取物，以1％的比例添加到公兔的日糧中，對公兔的性反應時間和精液品質等指標進行評

3、定。結果顯示，中藥提取物對公兔性反應時間的影響差別較大，醇提物組對性反應時間的改善效果顯著優(yōu)于水提組和對照組，以復方B最為明顯(P＜0.01)，水提物組對性反應時間的影響和對照組無明顯差異(P＞0.05)；在常規(guī)指標中，中藥復方提取物對精子的密度、射精量、精子活率都有明顯的改善效果；復方B的醇提物對精子密度的改善效果最為顯著，與其它組比較差異極顯著(P＜0.01)，對射精量和活率的改善效果較其余組差異明顯(P＜0.05)；但對精子畸形率

4、的影響較小(P＞0.05)；在對精子自身生物學功能及結構的檢查中，復方B醇提物能顯著改善精子質膜的完整率(P＜0.05)；除復方B醇提物外，其余中藥復方提取物對精子的頂體的保護作用無明顯差異(P＞0.05)。 2.本試驗在前一試驗的基礎上，對篩選出的復方B用70％乙醇進行精制，并按照提取物成分的性質進行分離，最后用紙色譜法對分離的成分進行定性研究。結果顯示，70％乙醇能有效地對復方中的成分進行提??；提取物中主要含有黃酮類、有機酸

5、類、生物堿以及糖類和氨基酸類物質。 3.嘗試建立兔睪丸間質細胞體外培養(yǎng)體系。試驗中將獲得的兔睪丸分成4組，進行不同的處理：A組在4℃PBS中保存3h后，進行消化處理；B組立即進行消化處理；C組在4℃PBS中保存3h后，在34℃培養(yǎng)基中孵育15min后，進行消化；D組在消化前只進行34℃培養(yǎng)基孵育處理。消化后，將過濾法和Percoll梯度分離法結合在一起對獲得的細胞進行純化處理。結果顯示，C組的處理程序對細胞的獲取量、完整率的影響

6、效果與B組比較差異極顯著(P＜0.01)，與A組、D組比較差異顯著(P＜0.05)；同時，兩種純化方法結合可使睪丸間質細胞的純度平均達到92.55％；體外培養(yǎng)，睪丸間質細胞的貼壁、生長狀態(tài)良好。 4.本試驗將精制的復方B醇提物離心去除顆粒，并過濾除菌，溶解于培養(yǎng)基中。將純化好的睪丸間質細胞分成4組，添加含不同濃度中藥復方B醇提物的培養(yǎng)液，進行體外培養(yǎng)，對培養(yǎng)液睪酮水平和細胞的DNA損傷等指標進行檢測。結果顯示，中藥復方對睪丸間質

7、細胞睪酮的分泌有明顯的促進作用，10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml組能延長睪丸間質細胞睪酮的分泌高峰時間至36h，且能維持培養(yǎng)液中高水平睪酮含量至72h；添加復方B醇提物50μg/ml組和100μg/ml組培養(yǎng)的睪丸間質細胞培養(yǎng)一段時間后，細胞核明顯，胞質顏色變深，在高劑量組(100μg/ml)則出現細胞分布不均的現象；在睪丸間質細胞的單細胞凝膠電泳中，發(fā)現10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml試驗組個別細胞拖尾現象

8、極輕，幾乎沒有，而在100μg/ml組少數細胞有輕度的拖尾。 5.將復方B醇提物按一定比例添加到公兔日糧中，飼喂3周。飼養(yǎng)試驗結束后，將各組公兔的睪丸制成切片，同時分離培養(yǎng)睪丸間質細胞，觀察細胞的生長狀況并對睪酮的分泌水平進行測定。結果表明，各試驗組(0.0％組、0.5％組、1％組、2％組)的組織切片無任何病理變化；分離的睪丸間質細胞在體外貼壁、生長良好；且睪酮分泌水平與復方B添加的劑量成正相關。 綜上所述，通過檢測兔精