牛傳染性鼻氣管炎病毒gD基因的克隆表達(dá)及ELISA診斷方法初步建立.pdf_第1頁(yè)
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1、1.根據(jù)已發(fā)表的IBRV的gD基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)含有BamHⅠ，HindⅢ酶切位點(diǎn)引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增766bp的目的條帶gD，將gD基因克隆到原核表達(dá)載體pET32a，得到重組表達(dá)載體pET32-gD，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，分子量約為53KDa的帶有6個(gè)His標(biāo)簽的融合蛋白得到高效表達(dá)。表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，親和層析法純化，最后通過(guò)免疫印跡得到鑒定。 2.重組蛋白His-t

2、gD過(guò)柱純化后，作為抗原包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板，初步建立檢測(cè)IBRV抗體的間接ELISA診斷方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：酶標(biāo)板的變異系數(shù)為7.3％，抗原的最適包被濃度為37.4μg/ml，血清最適稀釋度為1∶80；最適封閉液為1％BSA，封閉時(shí)間為37℃1h，最佳血清及二抗反應(yīng)時(shí)間確定為37℃1h和0.5h；底物顯色液的最佳反應(yīng)時(shí)間為15min；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后確定陰陽(yáng)性的臨界值為0.5。用建立的ELISA方法檢測(cè)其它四種牛病的陽(yáng)性血清均為陰性。證

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