牛傳染性鼻氣管炎病毒PCR檢測方法的建立及在進境牛檢疫中的應(yīng)用.pdf

1、我國廣東、廣西、河南、河北、上海、山東、四川、甘肅、新疆、黑龍江和青海等地的黑白化奶牛、本地黃牛、水?；蜿笈＞蠭BR存在。該病廣泛分布于世界各地，迄今只有奧地利、丹麥、芬蘭、瑞士和瑞典消滅了該病，一些國家已啟動了控制程序。 該病的典型癥狀主要出現(xiàn)在上呼吸道，如化膿性鼻液伴有結(jié)膜炎，一般癥狀有發(fā)燒、抑郁、厭食、流產(chǎn)和奶產(chǎn)量下降。病毒感染生殖道導(dǎo)致外陰道炎和龜頭皮炎。該病雖死亡率較低，許多感染牛呈亞臨床癥狀經(jīng)過，但常處于潛伏感染和

2、長期排毒，在運輸、擁擠等應(yīng)急條件下常導(dǎo)致發(fā)病及繼發(fā)感染，由于其流行范圍廣，對牛產(chǎn)奶量、繁殖力和役牛的使役能力均有較大影響，并嚴重影響國際牛業(yè)貿(mào)易。 清除抗體陽性牛，排除潛伏感染動物是控制IBR的最簡單也是最好的方法。奧地利、丹麥、芬蘭、瑞士和瑞典等國由于采取捕殺抗體陽性牛，已將本病消滅。此捕殺措施是基于抗體陽性牛為病毒的攜帶者這一事實，所以關(guān)鍵問題是要建立一種足夠敏感的方法檢出IBR陽性牛。對IBR疾病的監(jiān)測與診斷，國際上已普遍

3、使用ELISA和病毒中和試驗進行BHV1抗體檢測，或從鼻拭子和其它臟器分離病毒并進行病原鑒定。到目前為止，PCR主要應(yīng)用于精液病毒檢測，而實驗證明PCR能夠快速靈敏的檢測牛的IBRV，特別是對IBRV的潛伏感染的診斷，在IBR的診斷特別是在牛業(yè)國際貿(mào)易中具有廣闊的應(yīng)用前景。 對進口牛的檢疫，我國目前的檢測方法是：在隔離檢疫期間，主要應(yīng)用ELISA或SN檢測血清樣品中BHV1抗體，采取BHV1抗體陽性牛鼻拭子樣品，接種MDBK細胞

4、，再用SN鑒定培養(yǎng)物中引起CPE的病毒，由于SN對技術(shù)要求較高，所需時間長，本文改用PCR鑒定病毒，簡便快速。 本研究根據(jù)BHV1的gB基因序列設(shè)計一對引物，對IBRV進行PCR檢測，并對反應(yīng)條件進行優(yōu)化，應(yīng)用于進口牛檢疫，結(jié)果，最佳反應(yīng)條件為：變性溫度為95℃，退火溫度為64℃，72℃延伸，循環(huán)次數(shù)為35個循環(huán)，Mg2+的最佳濃度為1.6mM，dNTPs的最佳反應(yīng)濃度為0.36mM，引物的最佳濃度為0.2pmol/uL，Taq

5、酶的最佳濃度0.4U/50uL。用這對引物擴增IBRV、HCV、PRRSV、PRV，只有IBRV擴增出期望的362bp的特異性條帶，具有特異性。該PCR方法的檢測敏感度為1.2ng/50uL，說明其具有很好的敏感性。 在對3000多頭進口奶牛實施隔離檢疫期間，采取其血清進行牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的ELISA檢測，結(jié)果血清IBR抗體陽性數(shù)量達到1293頭，陽性率高達42﹪。采集陽性牛鼻拭子用MDBK細胞進行病毒分離，應(yīng)用以上所建

6、立的PCR反應(yīng)體系對病毒分離物進行檢測，從5份分離物中擴增出與預(yù)計大小(362bp)相吻合的基因片段，測序結(jié)果表明該序列與IBR標準毒株的序列完全一致。這些病毒分離株用BHV1陽性血清進行病毒中和試驗，病毒能被陽性血清中和，MDBK細胞不出現(xiàn)CPE，而用陰性血清則出現(xiàn)典型的細胞病變，即細胞變圓、卷縮成葡萄串樣等。同時將分離毒作負染電鏡觀察，可見病毒粒子呈球形，含囊膜，直徑約175～200nm。PCR檢測結(jié)果與SN、序列分析及電鏡觀察結(jié)果