大體積工程化脂肪組織構建條件的比較研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 臨床上因先天性畸形、外傷及腫瘤切除術等各種原因造成的大體積軟組織缺損一直是整形修復外科面臨的重大挑戰(zhàn)之一。2011年美國有近5百萬例的修復重建手術，78％為修復重建腫瘤切除術后的軟組織缺損。全球范圍內每年大約有130萬乳腺癌新病例，乳癌切除后必將造成大范圍的軟組織缺損。手術治療這類軟組織缺損的目的不僅僅是為了填充凹陷，更重要的是要形成具有自然外觀和美學功能、與身體周圍組織結合并長期維持穩(wěn)定的自然組織。

2、r>　　 傳統(tǒng)的乳房再造的手術方案多采用自體皮瓣或脂肪瓣轉移修復。術后都不可避免地造成供區(qū)不可逆的畸形與疤痕。因此能夠構建定形狀、定體積、可供移植的軟組織瓣成為了臨床醫(yī)師的“終極夢想”。
　　 脂肪組織工程技術為解決軟組織缺損的修復提出了全新的思路。1999年Patrick利用前脂肪細胞在聚乳酸乙醇酸材料上成功構建出脂肪組織，通過將特異性種子細胞種植于生物活性支架材料上，通過種子細胞和材料的相互作用促進細胞的增殖和分化，首先實

3、現了在體內外構建工程化脂肪組織的嘗試。但直至近期的報道，不管是通過優(yōu)化種子細胞或者改性生物活性材料或者改善局部微環(huán)境，最終構建的工程化脂肪組織，其體積都沒有超過1ml，并且在組織構成和組織穩(wěn)定上都難以達到滿意的結果。
　　 隨著深入的研究，目前認為組織工程化脂肪組織的體積主要取決于:①構建物早期的快速血管化，這是限制組織工程技術最終構建物體積以及組織結構成熟的關鍵因素;②可隨構建物動態(tài)發(fā)展、可控降解、組織相容性良好的生物材料;③

4、符合構建物發(fā)生發(fā)展的生長因子梯度及微環(huán)境;④穩(wěn)定的物理屏障以保障構建物體積和組織形態(tài)的長期穩(wěn)定。
　　 對于如何促進早期構建組織的血管化這個關鍵問題，許多學者提出不同的實驗方案，如局部加入促血管生長因子（VEGF、FGF、HGF等），病毒載體轉染促血管生成基因，不同種子細胞共培養(yǎng)等，以使早期構建物盡快血管化;通過直接添加或者緩釋技術等添加各種生長因子，但是目前為止都未能明顯改善最終構建物的體積。
　　 針對這些關鍵因素，

5、Hofer等人于2003年提出“組織工程室技術(TissueChamber Technique)”的概念，即采用生物惰性材料制作有一定硬度的保護性容器，將軸形血管或不同組織轉移到其內部，為擬構建的組織提供血運基礎、營養(yǎng)物質和生長所需空間，稱為血管化組織工程室。這種創(chuàng)新型的構建模式思路為我們的組織工程研究大大拓寬了道路，通過引入在體的血管蒂，使移植物能夠在早期獲得充足的血供和營養(yǎng)，極大提高種子細胞的存活率。局限性的工程室能夠將支持組織新生

6、相關的生長因子限制在工程室室內，并隨著組織的動態(tài)發(fā)展提供相應的變化，同時硬性的工程室外殼為新生物提供堅固的物理支撐，保障構建物的生長。這種新型的構建模式似乎相應地解決了傳統(tǒng)組織工程化組織的體積大小受限的幾個關鍵問題。
　　 但是脂肪組織本身具有很獨特的生理結構，脂肪組織中除了豐富的血管網絡之外，90％的空間由高耗氧、高耗能的脂肪細胞構成，同時作為機體重要的內分泌器官，脂肪組織能分泌多種脂肪因子，同時參與血管化和脂肪化的過程，單純

7、促進血管化能否構建出完整成熟的脂肪組織？脂肪組織內和脂肪組織周圍的局部微環(huán)境是否影響最終新生構建物的組織形態(tài)和成熟程度？如何協(xié)調地促進血管化和脂肪化的相互作用？歸根結底來說，就是如何利用組織工程室模型，闡明工程室內各種微環(huán)境對新生組織的影響，最終誘導大體積成熟工程化脂肪組織。
　　 圍繞這幾個科學問題，本實驗先是研究了利用組織工程室模型和預構技術，通過加強早期血管化，觀察外源性種子細胞在新生組織中的功能和最終的組織結構，探討通過

8、單純促進血管化策略是否能構建出大體積的新生組織。而后通過對組織工程室內單純成脂微環(huán)境和內環(huán)境的對比，揭示局部微環(huán)境對于構建大體積新生組織的影響。最后在工程室內植入帶有軸形血管蒂的脂肪瓣誘導新生組織，探討利用自體組織脂肪再生的相關機制。
　　 方法：
　　 1、預構富血管工程化組織構建大體積新生組織的設想及實驗證實
　　 通過利用組織工程室模型和預構技術，先構建出富血管化的支架載體，然后加入標記后脂肪組織特異性種子

9、細胞SVF，通過觀察新生組織的體積大小、組織形態(tài)、對種子細胞的功能進行評價，探討促進局部血管化對于構建大體積新生組織的可能性。
　　 2、組織工程室內內環(huán)境誘導大體積脂肪組織新生
　　 利用組織工程室模型，通過在對工程室內內環(huán)境的檢測，觀察組織學形態(tài)、新生細胞來源、室內內環(huán)境動態(tài)變化，探討室內局部內環(huán)境對于新生構建工程化組織的影響，證實單純成脂微環(huán)境和局部內環(huán)境對大體積脂肪組織的誘導作用。
　　 3、組織工程室誘

10、導大體積脂肪組織新生的構建策略
　　 將帶有軸形血管蒂的脂肪瓣植入組織工程室內，不加入外源性種子細胞和生物支架，利用脂肪瓣內成熟的血管化和脂肪化，通過在工程室內同時提供血管化和成脂化的微環(huán)境，進行大體積脂肪組織的新生誘導，并通過連續(xù)時間點的組織學觀察和相關因子檢測初步探討工程室誘導脂肪組織新生的相關機制。
　　 4、統(tǒng)計學處理
　　 數據以均數±標準差（(x)±s）表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行數據處理。

11、兩組之間比較采用配對t檢驗;不同時間點的差異采用協(xié)方差分析。
　　 結果：
　　 1、利用組織工程室和單純血管蒂能夠誘導出大于1ml的以富血管化纖維結締組織為主的新生組織，加入脂肪組織特異性外源性種子細胞，成功構建出1.1ml的新生組織，組織結構主要是纖維結締組織，可見大量新生血管，但未見到明顯脂肪組織結構。
　　 2、在工程室內單純添加成脂誘導環(huán)境，最終形成的新生組織以纖維結締組織為主，未見明顯血管形成。不添加

12、任何外源性干預因素的情況下，利用組織工程室，發(fā)現術后兩個月，小室內可見明顯組織新生形成凸起，組織學染色證實為成熟脂肪組織。室內組織液中細胞數目15天為最高，45天至60天趨于穩(wěn)定，VEGF及MCP-1水平隨時間變化逐漸降低，最終趨于穩(wěn)定，各時間點之間不存在顯著性性差異。在血管周發(fā)現CD34和圍脂滴蛋白雙陽性細胞，提示有間充質干細胞在室內進行分化成熟。但是最后形成的新生組織體積小并且局限于包膜內。
　　 3、在工程室內植入帶有軸形

13、血管蒂的脂肪瓣，4周后成功構建出3.03ml新生組織，組織學染色發(fā)現新生組織最外側可見一薄層纖維包膜，較為致密，厚度均一，原生組織與新生組織未見明顯區(qū)別，整個組織可見大量單房脂肪細胞聚集成團，纖維束將其分割成大量小葉樣組織，中間可見大量血管分布，管腔中央有紅細胞提示為成熟通暢血管。新生構建物同正常脂肪組織脂肪小葉結構相似。通過連續(xù)時間點觀察發(fā)現新生組織存在動態(tài)變化的重塑過程。早期主要以大量單房脂肪細胞增生、自組裝纖維蛋白原基質的沉積以及

14、炎性反應為主，并不伴有血管的長入。而后出現血管長入，后期主要是新生組織中脂肪細胞、血管和細胞外基質進行動態(tài)重塑，最終形成具有標志性脂肪小葉的成熟脂肪組織。
　　 討論：
　　 目前臨床上修復大體積軟組織缺損主要是自體皮瓣和脂肪瓣轉移法，術后都不可避免地造成供區(qū)不可逆的畸形與疤痕。利用傳統(tǒng)的組織工程三要素很難獲得大體積成熟脂肪組織，關鍵在于誘導過程中不能滿足血管化和脂肪化的協(xié)調發(fā)展，早期血供的延遲成為構建大體積工程化脂肪組

15、織的瓶頸。2003年“組織工程室”概念的提出為解決這個問題提供了新的視角。
　　 組織工程室可以在早期通過組織創(chuàng)傷釋放的生長因子作用下由在體血管蒂迅速促進新生血管網的成熟;并且在室內局部富集生長因子和細胞因子，為室內內容物的生長提供穩(wěn)定的內環(huán)境;具有一定硬度的工程室能夠為室內容物的生長提供穩(wěn)定的物理支撐，改變新生組織所處的力學環(huán)境，為大體積脂肪組織的誘導新生提供了可行的思路。
　　 但是鑒于脂肪組織結構的特殊性，組織工程

16、室模型中真正能影響大體積成熟脂肪組織構建的決定因素至今尚不清楚，這樣影響了大體積工程化脂肪組織的構建策略。脂肪組織的增長需要豐富的血管網絡和局部成脂微環(huán)境的同時存在，這是間充質干細胞進行分化的必要條件，只有是血管化和成脂化相互協(xié)調發(fā)展，才能最終保證大體積成熟脂肪組織的構建成功。
　　 通過我們的實驗，將單純血管束植入工程室內，最終能得到了大于1ml的富血管化新生組織，但其組織類型主要以纖維結締組織為主。在這個室內富血管床中添加脂

17、肪組織特有的SVF細胞，最終形成的新生組織可見大量的血管，但是結構依然為纖維結締組織，未見到明顯實質組織結構?？梢娫谌鄙傧鄳芍h(huán)境的誘導，即使特異性的外源性干細胞能在早期獲得充足的血供，但由于微環(huán)境的缺乏依然不能自主分化形成脂肪細胞，導致難以對工程化組織的組織形態(tài)實現定向控制，不能構建出大體積的新生脂肪組織。單純在室內加入脂肪組織塊作為成脂微環(huán)境，最終因為缺少血液的供應，新生組織依然為纖維結締組織并缺少血管長入。通過室內內環(huán)境的連續(xù)

18、觀察，我們發(fā)現工程室內早期的組織滲出液中含有大量的生長因子和細胞成分，這些細胞主要分布于血管周圍并且表達CD34和圍脂滴蛋白雙陽性，提示這些細胞可能來源于循環(huán)中的間充質干細胞成分，最終形成的脂肪細胞可能就是這些間充質干細胞在包膜內的成脂環(huán)境誘導下增殖分化而來。但是這中新生的組織遠遠體積較小，限制在包膜內，遠遠達不到臨床上的要求。可見在缺少成血管和成脂誘導下，單純依靠室內內環(huán)境，最終難以形成大體積可供移植的脂肪組織。
　　 通過在

19、工程室內植入帶有軸形血管蒂的脂肪瓣，同時成血管和成脂微環(huán)境完美結合，4周后即能得到3.03ml的成熟工程化脂肪組織，并且新生組織形狀同工程室形狀相似。通過連續(xù)時間點觀察發(fā)現新生組織存在動態(tài)變化的重塑過程。早期首先出現的是大量單房脂肪細胞在自組裝纖維蛋白原基質上增殖、分化，這個過程并不伴有血管的長入。而后才出現血管長入，后期主要是新生組織中脂肪細胞、血管和細胞外基質進行動態(tài)重塑，最終形成具有標志性脂肪小葉的成熟脂肪組織。這種大體積工程化脂

20、肪組織構建策略的實現對于臨床上各種不同部位、不同形式的大體積軟組織缺損的修復提供了一種安全、穩(wěn)定且有效地新途徑。
　　 結論：
　　 1、單純通過促進血管化，只能構建出富血管化的纖維結締組織，并不能誘導種子細胞的定向成脂分化，不能誘導大體積的脂肪組織新生。
　　 2、在缺乏血管化和成脂化的工程室內，難以短期形成大體積可供移植的脂肪組織，單純提供成脂環(huán)境不能形成富血管化的成熟脂肪組織。
　　 3、將帶有軸性