構建組織工程化毛囊的初步研究.pdf

1、研究背景： 毛囊是由上皮成分和真皮成分組成的。其中毛乳頭細胞是構成毛乳頭的主要間質細胞，它們是-簇特化的成纖維細胞。所有的毛乳頭細胞在外觀上都呈成纖維細胞樣，而且體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞有著聚集性生長的特性。毛乳頭在毛囊的形態(tài)學發(fā)生及周期調控中起著重要的作用。真皮鞘是圍繞毛囊最外層的真皮源性組織，在毛囊的再生過程中，可以觀察到真皮鞘細胞向毛乳頭細胞的轉化。有研究認為真皮鞘細胞是毛乳頭細胞的儲備細胞，毛乳頭部位的真皮鞘細胞與毛乳頭具有

2、相同的誘導能力。 I型膠原蛋白是目前組織工程研究中最常用的天然生物材料，由多種糖蛋白分子組成，它具有多方面的生物活性，不僅是組織支持物，而且是細胞外間質的重要成分。研究表明，膠原蛋白生物相容性好，降解速度可調，而且可參與組織修復，是一類優(yōu)良的可引導組織再生的生物材料。 DiI是一種親脂性碳花青染料，易嵌入生物質膜內作側向擴散運動，從而標記整個細胞膜，還可以通過活體細胞的胞飲作用進入胞漿，標記整個細胞漿。以往研究顯示，Di

3、I對活體細胞無毒性，對被標記細胞的存活、生長無影響。并有研究報道DiI可作為熒光示蹤劑用于培養(yǎng)的神經(jīng)細胞。 研究目的： 1.建立高效、快速分離培養(yǎng)毛乳頭細胞、真皮鞘細胞和毛囊上皮細胞，包皮表皮基底細胞的方法。 2.選擇適合于細胞生長的支架及細胞標記方法，建立毛囊細胞器官型培養(yǎng)的模型。 3.探索有效的動物體內毛囊重建的方法。 研究方法： 1.人毛囊真皮成分和表皮成分細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。將

4、人頭皮標本剪成小塊，中性蛋白酶中37℃孵育2h后鏡下將帶外根鞘的毛干從真皮鞘中拔出，組織塊法培養(yǎng)外根鞘隆起細胞；從真皮-皮下組織交界處橫斷頭皮，拔出含毛乳頭的真皮鞘，膠原酶D37℃孵育6~8h，多次低速離心，毛乳頭沉淀重懸后培養(yǎng)，收集的真皮鞘細胞上清液經(jīng)高速離心后重懸培養(yǎng)：真皮鞘和毛乳頭的分離也可采用顯微解剖法。觀察其在體外培養(yǎng)的形態(tài)學和生物學特點，比較兩種分離方法毛乳頭的貼壁率，培養(yǎng)的Bulge細胞和毛乳頭、真皮鞘細胞分別用K19或α

5、-平滑肌動蛋白免疫組化鑒定。 2.鼠觸須毛乳頭細胞和鼠觸須毛囊上皮細胞的分離、培養(yǎng)。采用顯微解剖法進行大鼠觸須毛乳頭細胞分離、培養(yǎng)，大鼠麻醉后修剪頰側被毛，常規(guī)消毒后剪去全層皮膚，暴露其下方的觸須毛囊，然后用鑷子將其完整拔出，用顯微解剖法分離毛乳頭。將分離的毛乳頭置入含15％FCS的DMEM培養(yǎng)基，以適當密度接種，觀察其在體外培養(yǎng)的形態(tài)學和生物學特點。鼠觸須毛囊上皮細胞的分離、培養(yǎng)：參照文獻中的操作進行，無菌條件下取7日齡Wis

6、tar大鼠觸須部皮膚，鏡下將毛囊從組織中分離出來，置入0.125％Dispase消化液中，4℃消化2h后，鏡下輕壓毛球部即可將毛囊外根鞘及毛干完整地分離出來。切去帶外根鞘的毛干中下段和上段，保留Bulge區(qū)毛囊。將分離的Bulge區(qū)毛囊置入無血清的K-SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。觀察其在體外培養(yǎng)的形態(tài)學和生物學特點。 3.包皮表皮基底細胞的分離、培養(yǎng)。采用IV型膠原快速粘附法培養(yǎng)包皮表皮細胞。包皮標本用含雙抗的D-Hanks液反復沖洗，

7、室溫下浸泡30min，剔除皮下組織，將包皮剪成1.0cmx0.5cm大小皮條，置0.5％的中性蛋白酶中，4℃消化12～15h，PBS沖洗2次，將表皮層撕下，剪成1mm×1mm大小皮片，置0.25％胰酶中，37℃消化5min左右，中止消化，過200目篩網(wǎng)，計數(shù)，離心，重懸，接種于預先鋪有Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶中，室溫下靜置10min，換液，吸附未貼壁的角質細胞。觀察其在體外培養(yǎng)的形態(tài)學和生物學特點。 4.細胞膠原凝膠制備。取傳代培養(yǎng)數(shù)次

8、的鼠毛囊毛乳頭細胞和外根鞘細胞分別為6x105和3×105梯度離心后加入0.5ml胎牛血清。吸4ml鼠尾膠原于冰浴中的青霉素小瓶中，加入0.5ml濃縮10倍的DMEM培養(yǎng)基，1NNaOH調Ph。立即加入含鼠毛囊毛乳頭細胞和外根鞘細胞的胎牛血清細胞懸液，快速混合，制成細胞膠原凝膠，然后吸到35mm培養(yǎng)皿中。靜置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2孵箱培養(yǎng)。 5.用DiI標記人毛囊毛乳頭細胞和外根鞘細胞，包皮表皮基底細胞。將收集細胞

9、用PBS清洗離心2次，加入無血清的DMEM制成細胞懸液，以1×109/L密度加入5μLDiI應用液，37℃下孵育25min，1500r／min離心5min，PBS清洗離心2次，加入10％DMEM培養(yǎng)基中，熒光顯微鏡觀察細胞顯色情況，置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2孵箱培養(yǎng)，觀察24，48，72h細胞熒光強度及形態(tài)變化。 6.細胞一支架復合物的形成。將I型膠原蛋白海綿支架材料裁制成10mm×10mm×10mm大小，利用紫外線

10、照射及酒精浸泡消毒，培養(yǎng)液平衡后待用。DiI標記的人毛乳頭細胞和外根鞘細胞、包皮表皮基底細胞消化后制成細胞懸液，分兩組，細胞密度為2×105／ml，表面種植1ml細胞懸液，靜置4h后，加入含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡，觀察細胞在支架上黏附、生長情況。 7.裸鼠體內誘導實驗。將鼠毛囊細胞膠原凝膠在無菌條件下注射移植到裸鼠背部兩側的皮下。于4周切下移植部位皮膚，石蠟切

11、片行H-E染色光學顯微鏡下觀察；人細胞-支架復合物在無菌條件下注射移植到裸鼠背部兩側的皮下，分別于6、8、12周切下移植部位皮膚，冰凍切片和石蠟切片熒光顯微鏡下觀察，并進行H-E染色光學顯微鏡下觀察。 研究結果： 1.結合運用顯微法和酶消化法等基本分離技術，同時從頭皮毛囊標本中分離培養(yǎng)毛囊三種細胞成分，獲得了較純化的外根鞘Bulge細胞，真皮鞘細胞和毛乳頭細胞。酶消化法獲得的毛乳頭貼壁率高，可達到90％，毛乳頭和真皮鞘細

12、胞體外培養(yǎng)表現(xiàn)出明顯的凝集性生長，α-SMA免疫組化染色呈現(xiàn)陽性。組織塊法培養(yǎng)的頭皮毛囊外根鞘Bulge細胞，可在K-SFM培養(yǎng)基中生長良好，呈鋪路石樣。角蛋白19免疫組化染色陽性。 2.采用顯微解剖成功分離大鼠觸須毛乳頭細胞，細胞體外培養(yǎng)表現(xiàn)出明顯的凝集性生長。采用酶消化法和顯微解剖法成功分離到大鼠觸須毛囊上皮細胞，可在K-SFM培養(yǎng)基中生長良好，呈鋪路石樣。 3.采用Ⅳ型膠原快速粘附法培養(yǎng)的包皮表皮基底細胞外培養(yǎng)過程

13、中呈典型的克隆性生長，生長周期長。 4.剛接種于膠原凝膠的細胞呈圓形，在膠原凝膠內均勻分布。24h內細胞伸展，粘附，2d后部分細胞已伸展變形，以三角形和梭形為主。 5.DiI標記的人毛乳頭細胞、外根鞘細胞和包皮表皮基底細胞熒光顯微鏡下觀察，見全部細胞標記后均顯紅色熒光，標記的細胞呈梭形或圓形，胞漿豐富，保持了良好的正常形態(tài)，DiI標記陽性率為100％。DiI標記后早期細胞形態(tài)呈熒光環(huán)狀，48h后細胞中熒光顆粒增多，熒光增

14、強，細胞核未染熒光。 6.細胞-支架復合物體外倒置顯微鏡下和掃描電鏡觀察，將毛乳頭細胞、毛囊外根鞘細胞和包皮表皮基底細胞在材料上接種并在孵箱孵育2h后，材料周邊及孔板底部開始有細胞黏附，隨著時間的延長，附著于材料上的細胞逐漸增多；培養(yǎng)2-3天后，細胞在材料上逐漸伸出突起，可見大量細胞附著于材料的孔隙及材料周邊，膠原蛋白材料上皆有細胞附著，細胞呈梭形圓形或多角形，部分材料上的細胞呈團簇狀生長，粘附于膠原海綿壁上或孔隙內，各細胞或細

15、胞團之間通過基質相連或重疊。細胞種植3d后，細胞呈扁平多角形或圓形，在材料表面伸展、黏附，種植1周后，形態(tài)為梭形或圓形，細胞數(shù)量明顯增多，呈聚集性分布，細胞周圍有大量基質。 7.裸鼠體內誘導實驗。裸鼠背側皮膚觀察未見有肉眼可見的毛發(fā)纖維生成。石蠟切片光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)鼠細胞膠原凝膠誘導實驗組和人細胞-I型膠原蛋白支架復合物毛乳頭細胞與毛囊上皮Bulge細胞組合、毛乳頭細胞與包皮表皮基底細胞組合誘導實驗中4周、8周、12周均可見

16、新生毛囊樣結構形成。空白支架對照組無毛囊樣結構生成。石蠟切片熒光顯微鏡下觀察DiI標記的人毛乳頭細胞、外根鞘Bulge細胞組合和DiI標記的人毛乳頭細胞、包皮表皮細胞組合實驗組新生毛囊樣結構顯紅色熒光。未用DiI標記的實驗對照組新生毛囊樣結構無紅色熒光顯示。 研究結論： 1.結合運用顯微解剖法和酶消化法等基本分離技術，避免了單獨運用顯微法和酶消化法的缺點，并在分離步驟和次序上進行改進，首次同時從頭皮毛囊標本中分離培養(yǎng)毛囊

17、三種細胞成分，最大限度的利用了標本量，毛囊毛乳頭因為經(jīng)過膠原酶的處理，其貼壁與融合時間與文獻報道的兩步酶法無明顯差別。因毛囊各種細胞成分來源于同一標本，進行細胞組合誘導等毛囊試驗時避免了毛囊各細胞因來源不同而在毛囊組織工程中組合應用可能面臨的免疫原性問題。 2.經(jīng)Ⅳ型膠原快速粘附法多次篩選的包皮表皮細胞外培養(yǎng)過程中呈典型的克隆性生長，生長周期長。說明用這種方法培養(yǎng)篩選的包皮表皮基底細胞可能含有較多的未分化表皮干細胞。 3

18、.DiI標記的人毛乳頭細胞、外根鞘細胞和包皮表皮基底細胞標記陽性率為100％。細胞在I型膠原蛋白支架上形態(tài)為梭形或圓形，呈聚集性分布，細胞周圍有大量基質，表明細胞在支架上粘附、伸展和生長良好。 4.裸鼠體內誘導實驗組織切片觀察DiI標記的人毛乳頭細胞、外根鞘Bulge細胞組合和DiI標記的人毛乳頭細胞、包皮表皮基底細胞組合實驗組新生毛囊樣結構顯紅色熒光。未用DiI標記的實驗對照組新生毛囊樣結構無紅色熒光顯示。證明了新生的毛囊是由