溶癌腺病毒ZD55-IL24殺傷舌鱗癌細胞的體外實驗研究.pdf

1、背景與目的舌癌是最常見的口腔腫瘤。迄今為止，治療上主要依靠外科手術和放療，但并未明顯提高患者的生存率。從腫瘤生物學特點出發(fā)研究新的治療方法是舌癌治療研究的重要方向。腫瘤的生物基因治療是目前研究的熱點，有學者應用反義RNA、自殺基因、免疫調節(jié)基因等進行了實驗研究。在基因治療中導入系統(tǒng)的發(fā)展是極其重要的，目前主要包括病毒載體和非病毒載體。病毒載體由于轉染效率高等優(yōu)勢，目前應用較為廣泛，其中包括轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體等。腺病

2、毒載體由于具備不整合入染色體、容易制備等特點，在基因導入方面具有獨特的優(yōu)勢。由于前兩代腺病毒載體外源基因表達時間短等缺陷，尋找新型的腺病毒載體是現(xiàn)在發(fā)展的方向，其中溶癌腺病毒就是一種第三代的腺病毒載體。 溶癌腺病毒是通過對腺病毒的基因改造使其復制具有腫瘤特異性，而對正常細胞幾無影響；在腫瘤細胞中復制后可裂解腫瘤細胞，并釋放出子代病毒，感染周圍腫瘤細胞，直至完全殺滅腫瘤。國外應用溶癌腺病毒治療腫瘤取得一定進展，但臨床試驗表明溶癌腺

3、病毒并未達到理想的抗腫瘤效應。因此，有必要對這種溶癌腺病毒進一步改造，使其攜帶抗癌基因，增強其抗癌作用。 本實驗通過構建攜帶IL-24的溶癌腺病毒載體ZD55，觀察其對舌鱗癌細胞株Tca8113的轉染效果、體外作用并且探討其可能的機制。 方法1、利用攜帶有能表達綠色熒光蛋白的腺病毒載體ZD55-GFP(Greenfluorescentprotein)，體外轉染舌鱗癌細胞株Tca8113，在熒光顯微鏡和相差顯微鏡下觀察轉染

4、效果。 2、應用流式細胞術定量檢測GFP的表達量。 3、Westernblot檢測舌鱗癌細胞株Tca8113的CAR(thecoxsackie-adenovirusreceptor)的表達。 4、應用MTT法，檢測ZD55-IL24對舌鱗癌細胞株Tca8113增殖的影響。 5、應用結晶紫染色，檢測ZD55-IL24對舌鱗癌細胞株Tca8113的細胞毒性作用。同時還檢測了對正常人肺成纖維細胞(normalh

5、umanlungfibroblasts,NHLF)的毒性作用。 6、Westernblot檢測ZD55-IL24轉染后舌鱗癌細胞株Tca8113的caspase-3的表達。 結果熒光顯微鏡結果顯示，不同感染復數(shù)(MultiplicityofInfection，MOI)的ZD55-GFP轉染Tca8113細胞株48小時后，能夠表現(xiàn)不同強度的熒光。隨著感染復數(shù)的提高，熒光強度相應增強。相差顯微鏡結果顯示，感染后的細胞形態(tài)發(fā)生

6、了明顯改變。采用流式細胞術檢測顯示，隨著感染復數(shù)的增加，熒光蛋白的表達量也相應提高。 通過Westernblot檢測Tca8113的CAR的表達狀況，相比于白血病細胞株K562、Kassumi，舌鱗癌細胞株Tca8113具有較明顯的CAR表達。采用MTT比色法檢測ZD55-IL24對Tca8113的增殖影響。結果顯示，不同感染復數(shù)(0、1、10、100MOI)的ZD55-IL24處理Tca8113細胞株5天后，具有明顯的抑制作用

7、，且表現(xiàn)為劑量依賴性。相同感染復數(shù)(100MOI)的ZD55-IL24處理Tca8113細胞3、5、7天后，結果顯示，對Tca8113具有明顯的抑制作用，且表現(xiàn)為時間依賴性。 通過結晶紫染色法觀察了ZD55-IL24、ZD55-GFP、Ad-IL24對Tca8113細胞株、NHLF(nonnalhumanlungfibroblasts)的細胞毒性作用。結果顯示，處理5天后，相比空白對照組ZD55-IL24、ZD55-GFP對Tc

8、a8113有明顯的殺傷作用，Ad-IL24效果不明顯；且在相同感染復數(shù)時，ZD55-IL24作用的Tca8113細胞存活數(shù)比ZD55-GFP作用的少。而ZD55-IL24、ZD55-GFP、Ad-IL24處理NHLF5天后，結果顯示，相比空白對照組，并無明顯的細胞毒性作用。通過Westernblot技術在蛋白水平檢測100MOIZD55-IL24作用Tca8113細胞0、12、24、48h,可見caspase-3發(fā)生明顯的剪切，且隨著作

9、用時間的延長，剪切越明顯。 結論1、溶癌腺病毒ZD55能在體外成功轉染人舌鱗癌Tca8113細胞，且具有較高的轉染效率。 2、溶癌腺病毒ZD55-IL24對Tca8113細胞的具有明顯的生長抑制作用，且具有時間—劑量依賴關系。 3、溶癌腺病毒ZD55對正常人肺成纖維細胞無明顯細胞毒性作用。4、溶癌腺病毒ZD55-IL24對Tca8113細胞生長抑制作用通過誘導Tca8113細胞凋亡實現(xiàn)。 5、ZD55載體