miR-21調控舌鱗癌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、舌鱗狀細胞癌(tonguesquamouscellcarcinoma，TSCC)是最常見的口腔惡性腫瘤，約占口腔惡性腫瘤的43.4％。舌鱗狀細胞癌常造成患者的語言、進食等功能障礙及顏面部的畸形，嚴重影響患者的生存質量。舌鱗癌常常發(fā)生早期頸淋巴轉移，且轉移率較高。近二十年來，盡管臨床上舌鱗癌的綜合治療已經很普遍，但以手術為主，放化療為輔的綜合治療對舌鱗癌生存率的提高并不明顯，5年總體生存率仍然較低，徘徊在50％～55％左右，并沒有顯著提高

2、，中晚期患者的5年生存率更低，約為27％，而且這些方法都存在各自的局限性，特別是對中晚期和復發(fā)患者療效不佳，對伴有遠處轉移者療效更差。因此，尋找更安全有效的治療途徑是提高舌鱗狀細胞癌生存率和生存質量所亟待解決的難題。 大量的研究已經證實，人類疾病的發(fā)生發(fā)展直接和間接地與基因密切相關，因此，可以認為人類的疾病都是基因病。所以從本質上來說，舌鱗狀細胞癌也是一種基因病，與細胞的生長增殖和凋亡失控等密切相關。從理論上講，基因治療有望解決

3、這些問題，所以惡性腫瘤的基因治療是近十幾年來的研究熱點。但長期以來人們一直不遺余力地尋找某一基因和某一疾病的對應關系，由于概念與技術的局限，把這種尋找變成了一對一的簡單線性關系的研究，有“零敲碎打”之嫌，致使目前基因治療的效果不盡人意。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多個編碼基因的改變，只是單純抑制某個基因的表達，難以有效地起到抑癌作用?？上驳氖牵祟惢蚪M計劃已于2003年4月完成全部序列測定，進入了后基因組時代即功能基因組學時代，基因組科學完

4、成了一次歷史性轉折，而疾病基因組學也不斷取得成果，在觀念和技術上，初步實現(xiàn)了由“零敲碎打”向“整體闡明”的轉折。 舌鱗癌細胞與其它惡性腫瘤一樣，其生物學特性取決于其特異表達的基因，而在腫瘤發(fā)展過程中必然伴隨著不同的基因表達變化。那么，調控舌鱗癌細胞特異的基因表達及其發(fā)展過程中基因表達變化的生物學機制是什么？對于這一問題，雖然目前還沒有確切的答案，但是，近年非編碼RNA(non—codingRNAs)，特別是微小分子RNA(mic

5、roRNA，miRNA)調控基因表達研究的興起給回答該問題提供了新的線索。內源性miRNA可調控數(shù)十到數(shù)百個基因的表達，因此，腫瘤細胞內起到“促癌”和“抑癌”作用的非編碼miRNA比編碼的癌基因和抑癌基因少得多，可以成為更穩(wěn)定有效的抗癌靶點。 miRNAs的研究分析提示，miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程，包括發(fā)育、造血、器官形成、凋亡、細胞增殖，甚至是腫瘤發(fā)生。在眾多相關疾病中，惡性腫瘤的miRNA表達異常最受矚目。根

6、據(jù)高通量的miRNA微陣列和實時定量RT—PCR(quantitativereal—timePCR，qRT—PCR)分析，發(fā)現(xiàn)在多種人類惡性腫瘤中，包括結腸癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、胃癌、淋巴瘤、白血病等的miRNA表達譜與它們來源的正常組織存在很大區(qū)別，這種區(qū)別在低分化和惡性程度高的腫瘤組織表現(xiàn)得更顯著些。在某些惡性腫瘤中，miRNA含量比來源的正常組織明顯降低，腫瘤分化越差，miRNA的含量也越低，如在乳腺痛組織中，miR-10b、l

7、et—7、miR-125b和miR-145等的表達明顯下調。而某些miRNA在腫瘤組織內的表達卻有所上升，如乳腺癌中的miR—21和miR-155。惡性腫瘤miRNA表達的變化說明腫瘤細胞基因調控機制發(fā)生改變，與cDNA微陣列比較，miRNA表達譜能為癌腫的分子分期和分型提供更準確的信息。 隨著新的miRNA的不斷發(fā)現(xiàn)及其功能的逐漸明確，使得miRNA的研究倍受關注，成為當前研究的熱點之一。大量研究發(fā)現(xiàn)在癌細胞中表達異常的miR

8、NA的靶基因屬于癌基因或者抑癌基因，這些靶基因都與細胞的增殖、凋亡或分化密切相關。正是因為miRNA具有調節(jié)癌基因或者抑癌基因表達的功能，故其自身也充當著“抑癌基因”和“癌基因”的角色。然而在頭頸腫瘤，特別是以舌鱗癌為代表的口腔鱗狀細胞癌中相關miRNA及其功能的研究未見報道。本研究采用高通量的miRNA微陣列篩選出不同分期的舌鱗癌組織和癌旁正常組織中差異表達的內源性miRNA，獲得舌鱗癌細胞的miRNA表達譜；選取在早期和中晚期舌鱗癌

9、中都顯著高表達的miR-21為進一步研究對象，通過qRT-PCR驗證其在50例不同分期舌鱗癌組織中的差異表達；同時采用免疫組織化學方法檢測miR-21靶基因原肌球蛋白1(tropomyosin-1，TPM-1)在同樣50例舌鱗癌組織中的表達，并用Tunel凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡，結合患者的臨床資料統(tǒng)計分析相關指標之間的關系。在此基礎上，建立體外培養(yǎng)舌鱗癌細胞模型，檢測miR-21在細胞中的表達，并通過轉染miR-21拮抗物和TPM-

10、1siRNA對其調控功能進行分析研究。為闡明miRNA調控舌鱗癌細胞增殖、分化和凋亡的生物學機制提供新線索，以期為研制靶向舌鱗癌細胞的miRNA或其靶基因的新型基因藥物提供實驗依據(jù)。 第一部分舌鱗癌組織和癌旁正常組織miRNA差異表達分析 目前研究miRNA表達的方法有克隆測序、RNA印跡以及RNA酶保護分析(RNAaseprotectionassay，RPA)。但對于腫瘤研究，非常需要大規(guī)模比較腫瘤組織和正常組織中的m

11、iRNAs表達譜差異，以上的方法耗時耗力，檢測的通量不高。而基于熒光標記的基因芯片技術(Microarraytechnology)提供了大量檢測多種miRNAs表達的平臺。這一技術可以有效快捷地同時比較大量miRNAs表達變化情況，已在諸多實驗室被用于miRNAs的研究。RNA印跡和RT-PCR技術雖然是低通量的檢測技術，但芯片檢測的結果仍需要它們進行驗證。檢測成熟miRNA的PCR方法是最近才發(fā)展起來的方法，它是驗證miRNA芯片數(shù)據(jù)

12、或檢測單個miRNA表達的高靈敏度的方法。 本部分研究應用miRNA微陣列技術，初步分析舌鱗癌組織和癌旁正常組織miRNA表達譜的差異和不同分期的舌鱗癌miRNA表達譜變化。選取在早期和中晚期舌鱗癌中都顯著高表達的miR-21為進一步研究對象，通過qRT-PCR驗證其在50例不同分期舌鱗癌組織中的差異表達。 研究結果顯示： 1.舌鱗癌組織和癌旁正常舌黏膜組織中存在差異表達的miRNA分子。從總體上看，晚期舌鱗癌組

13、miRNA分子表達差異較大，早期組差異相對較小。 2.在早期舌鱗癌組中，與正常舌黏膜相比具有表達變化的miRNA分子有25個，其中上調表達的有10個(miR-16，miR—21，miR—31，…)，下調表達的有15個(miR—26b，miR-148a，miR-198，…). 3.在晚期舌鱗癌組中，與正常舌黏膜相比具有表達變化的miRNA分子有28個，其中上調表達的有26個，下調表達的有2個(miR—23a，miR—26a

14、)。 第二部分miR—21、TPM-1和細胞凋亡的相互關系及臨床意義 一些實驗和臨床研究證據(jù)都顯示，miRNAs可以作為一類新的腫瘤癌基因或者腫瘤抑制基因。當這些miRNAs的表達在腫瘤中增高的時候，就被看作癌基因，它們通過促進腫瘤增殖或者抑制腫瘤抑制基因，調控腫瘤細胞的分化和凋亡。目前研究已經發(fā)現(xiàn)很多miRNAs在不同的腫瘤中過度表達，它們都作為原癌基因促進腫瘤增殖，但是只有其中少數(shù)部分的功能研究得比較清楚。有學者對多

15、種腫瘤中都表達升高的miRNAs進行歸納，發(fā)現(xiàn)miR—21在幾種腫瘤中都是表達升高的。近年來，許多學者對TPM-1的組成結構及與多種腫瘤的關系進行了研究，普遍認為TPM-1作為一個抑癌基因有可能成為一種新的腫瘤標記物。國外的一項研究提示TPM-1是miR—21的一個靶基因，下調miR—21可提高TPM-1的表達，促進乳腺癌細胞的凋亡。 為了解miR—21、TPM-1表達與舌鱗癌細胞凋亡的相關性，本實驗采用免疫組織化學方法檢測mi

16、R—21靶基因TPM-1在同樣50例舌鱗癌組織中的表達，并用Tunel凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡指數(shù)(apoptosisindex，AI)，結合患者的臨床資料統(tǒng)計分析相關指標之間的關系。 第三部分miR—21對舌鱗癌細胞增殖和凋亡的調控 隨著越來越多的miRNAs不斷被發(fā)現(xiàn)，人們的研究焦點轉移到miRNAs的功能研究。miR—21作為人類細胞或組織中發(fā)現(xiàn)較早的、存在較為廣泛的miRNA，在人類miRNAs的功能研究中發(fā)揮

17、了不容忽視的作用。目前有多種研究miRNAs與所預測靶基因關系的方法得到了大家的認可，如采用報告基因載體法，通過對報告基因表達水平的檢測估計miRNA與靶序列的結合情況，另一個重要的方法是功能缺失試驗，即用2’—羥基甲基化的反義寡核苷酸(ASO)阻斷miRNA的功能。最為直接的證據(jù)仍然是借助于ASO的功能缺失試驗。 本實驗通過建立體外培養(yǎng)舌鱗癌細胞模型，檢測miR—21在舌鱗癌細胞株SCC-15和CAL27中的表達，并通過轉染m