抑癌基因IRF8在人乳腺癌中的表觀遺傳調(diào)控及功能機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過檢測抑癌基因干擾素調(diào)節(jié)因子8（Interferon regulatory factor8，IRF8）在人乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平以及在人乳腺癌組織中的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，分析IRF8啟動(dòng)子異常甲基化與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，研究IRF8對人乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、遷移侵襲等生物學(xué)行為的影響，驗(yàn)證IRF8是乳腺癌的抑癌基因，探討IRF8抑癌作用的分子機(jī)理，為乳腺癌的早期診斷、預(yù)后評估、新藥開發(fā)等奠定基礎(chǔ)

2、。
　　方法：
　　1.采用 real-time PCR檢測 IRF8在6株乳腺癌細(xì)胞（BT549、MDA-MB-231、MB468、MCF7、SK-BR-3及T47D）及乳腺上皮細(xì)胞 HBL-100中的表達(dá)，RT-PCR和 western blot檢測 IRF8在MDA-MB-231，T47D，SK-BR-3及HBL-100中的表達(dá)；
　　2.采用甲基化特異性PCR（Methylation-specific PCR，

3、MSP）檢測IRF8在人乳腺癌組織及癌旁組織中的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)分析IRF8啟動(dòng)子甲基化與人乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性；
　　3.通過查詢 GOBO數(shù)據(jù)庫（http://co.bmc.lu.se/gobo/），分析乳腺癌不同組織學(xué)分級中，IRF8表達(dá)與乳腺癌患者無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率（Distance metastasis free survival，DMFS）的關(guān)系；
　　4.在IRF8表達(dá)缺失的細(xì)胞株中外源性表達(dá)IRF8

4、，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測IRF8對乳腺癌細(xì)胞克隆形成能力的影響；CCK-8實(shí)驗(yàn)評估IRF8對乳腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)測量IRF8對乳腺癌細(xì)胞遷移的作用；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測 IRF8對乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的調(diào)節(jié)，流式細(xì)胞術(shù)量化 IRF8對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響；real-time PCR檢測遷移侵襲相關(guān)因子VEGF、MMP2和MMP9以及增殖標(biāo)記物K i-67表達(dá)變化；
　　5. MSP檢測IRF8在MDA-

5、MB231和SK-BR-3細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)；Real-time PCR驗(yàn)證IFN-γ對IRF8表達(dá)的調(diào)節(jié)作用；流式細(xì)胞術(shù)評估乳腺癌細(xì)胞中外源性表達(dá) IRF8對 IFN-γ促凋亡作用的影響；western blot檢測 IFN-γ對磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子1（phosphorylated signal transducer and activator of transcription1，p-STAT1）的調(diào)節(jié)作用。
　　6.利

6、用real-time PCR檢測IRF8對于JAK/STAT1信號通路關(guān)鍵信號分子JAK1、JAK2和STAT1的調(diào)節(jié)作用；western blot檢測IRF8對p-STAT1的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1. IRF8在6株人乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)較乳腺上皮細(xì)胞HBL-100顯著降低（P＜0.05），IRF8在MDA-MB231和T47D細(xì)胞株中表達(dá)缺失，SK-BR-3中低表達(dá)，HBL-100中高表達(dá)；
　　2.114例

7、人乳腺癌組織中，56例出現(xiàn)異常甲基化改變，IRF8在人乳腺癌組織中的異常甲基化率為49.12%（56/114），IRF8在人乳腺癌旁組織中甲基化率為7.69%（1/13），結(jié)合臨床資料，IRF8甲基化與乳腺癌臨床病理特征無相關(guān)性；
　　3.組織學(xué)分級為1級和2級的乳腺癌中，IRF8的表達(dá)與DMFS無相關(guān)性（P＞0.05），在3級乳腺癌中，IRF8高表達(dá)組的DMFS較IRF8低中表達(dá)組長，差異具有顯著性(P＜0.05)；
　　

8、4.在MB231和T47D細(xì)胞中，IRF8轉(zhuǎn)染組相對克隆形成數(shù)目顯著降低，分別為55.2±6.4、53.6±6.6(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染IRF8的MB231細(xì)胞較對照組在48h（0.26±0.007、0.38±0.012），72h（0.36±0.021、0.51±0.021），96h（0.43±0.039、0.61±0.040）生長減慢(P＜0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例增加(61.08±0.147、63.06±0.225)(P＜0.

9、05)，凋亡細(xì)胞比例上升（14.55±0.532、10.73±0.375）(P＜0.05)；MB231細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染IRF8組劃痕愈合時(shí)間減慢，而在T47D細(xì)胞中無明顯變化；MB231穿膜細(xì)胞數(shù)減少(24.6±2.5、5.3±1.5)(P＜0.05)；其中VEGF、MMP-9和Ki-67的表達(dá)顯著下降（P＜0.05），而MMP-2無顯著變化（P＞0.05）；
　　5. IFN-γ處理組和未處理組相比，pcDNA3.1/MB231和p

10、cDNA3.1-IRF8/MB231細(xì)胞中 IRF8的表達(dá)均無顯著變化（P＞0.05），SK-BR-3細(xì)胞中IRF8的表達(dá)隨IFN-γ濃度上升而顯著上調(diào)（P＜0.05）；IFN-γ未處理組與處理組之間的凋亡差值在pcDNA3.1-MB231(2.57±0.23) pcDNA3.1-IRF8-MB231和（6.92±0.312）兩組細(xì)胞之間具有顯著差異（P＜0.05），伴隨p-STAT1蛋白表達(dá)顯著上升；在pcDNA3.1-MB231和p

11、cDNA3.1-IRF8-MB231細(xì)胞中，IRF8促進(jìn)JAK2，STAT1的表達(dá)及p-STAT1蛋白表達(dá)，具有顯著差異（P＜0.05），而不影響JAK1表達(dá)（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. IRF8在人乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)顯著下調(diào)或缺失，在3級乳腺癌中，高表達(dá)IRF8具有較好的DMFS，IRF8可能為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因素；
　　2. IRF8盡管在人乳腺癌組織中出現(xiàn)異常高甲基化，但I(xiàn)RF8啟動(dòng)子甲基化與乳腺癌臨床病