北豆根總堿對Hela細胞抑制作用及其機制研究.pdf

1、目的：研究北豆根總堿對宮頸癌細胞Hela凋亡、細胞周期及侵襲性的影響，探討北豆根總堿抗腫瘤作用機制，為抗腫瘤新藥的研究和開發(fā)提供科學依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.采用四甲基偶氮唑藍法（MTT）檢測不同濃度北豆根總堿（3.125、6.25、12.5、25、50 μg/ml）處理不同時間（24、48和72小時）對Hela細胞增殖反應的抑制作用。
　　 2.采用流式細胞技術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測

2、不同濃度北豆根總堿（0、4、16、40μg/ml）作用48小時，對Hela細胞凋亡及周期變化的影響。
　　 3.瑞氏-姬姆薩染色后顯微鏡觀察北豆根總堿（0、40μg/ml）作用24小時后Hela細胞形態(tài)學變化。
　　 4.采用Transwell小室法檢測北豆根總堿（0、40pg/ml）作用24小時后對Hela細胞侵襲性的影響。
　　 5.采用免疫印跡（Western blot）方法檢測不同濃度北豆根總堿（0、4、

3、16、40μg/ml）作用24小時后，Hela細胞中磷酸化ERK（p-ERK）、ERK、C-myc、CyclinDl的表達變化。
　　 6.采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（revers transcription PCR，RT-PCR）半定量檢測北豆根總堿（0、4、16、40μg/ml）作用24小時，Hela細胞抗凋亡基因bcl-2、促凋亡基因bax、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達變化。
　　 7.應用激光共聚焦顯微鏡

4、（laser scanning microscope，LSM）觀察北豆根總堿（0、40μg/ml）作用24小時后，Hela細胞內(nèi)P-ERK.、ERK、Bcl-2、Bax蛋白的表達變化。
　　 結果：
　　 1.北豆根總堿對Hela細胞增殖有較強的抑制作用，隨著北豆根總堿濃度及作用時間的增加，對細胞的抑制率升高。其中50μg/ml北豆根總堿作用72小時對細胞抑制率最高（85.37％）；與對照組相比，不同濃度北豆根總堿對細胞

5、增殖的抑制率均有顯著性差異（p<0.05）。
　　 2.北豆根總堿能明顯誘導Hela細胞發(fā)生凋亡和細胞周期阻滯。隨著北豆根總堿作用濃度的增大，細胞的凋亡率升高，G0/G1期細胞明顯增多，S期細胞明顯減少，對照組與試驗組之間比較有顯著性差異（p<0.05）。
　　 3.北豆根總堿作用24小時后，Hela細胞形態(tài)呈現(xiàn)凋亡前期改變。
　　 4.Transwell小室侵襲實驗結果顯示，經(jīng)北豆根總堿（0，40μg/ml）作

6、用24小時后，穿膜細胞數(shù)較對照組顯著減少，存在顯著差異（p<0.05）。
　　 5.Western blot分析結果顯示，經(jīng)4、16、40μg/ml北豆根總堿處理24小時后，Hela細胞中磷酸化ERK、C-myc、CyclinD1表達水平與對照組細胞比較均有所下降，ERK表達無顯著性變化。
　　 6.半定量RT-PCR檢測結果顯示，經(jīng)不同濃度北豆根總堿處理后，Hela細胞抗凋亡基因bcl-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9MMP-9

7、 tuRNA表達水平逐漸降低，促凋亡基因bax mRNA表達水平逐漸增高，與對照組比較有顯著性差異（p<0.05），該現(xiàn)象隨著濃度北豆根總堿濃度的升高而更加明顯，呈明顯的濃度依賴性。
　　 7.LSM熒光圖像分析結果顯示，北豆根總堿（40μg/ml）作用24小時后，Hela細胞內(nèi)抗Bax蛋白抗染色的熒光強度較對照組明顯增加，抗P-ERK、Bal-2抗體熒光強度較對照組明顯降低，ERK抗體熒光強度較對照組無明顯變化。
　　

8、 結論：
　　 1.北豆根總堿在一定濃度范圍內(nèi)，能抑制宮頸癌細胞Hela的增殖，具有明顯的量效關系。
　　 2.北豆根總堿可通過降低Hela細胞中磷酸化ERK（P-ERK）水平，抑制Hela細胞ERK1/2信號轉導通路。
　　 3.北豆根總堿通過抑制Hela細胞ERK1/2信號轉導通路，減弱bcl-2，MMP-9 mRNA表達，增強bax mRNA表達，減弱Hela細胞中C-myc、Cyclin D1蛋白的表達，