17β-群勃龍對大鼠海馬神經元的影響及其作用機制研究.pdf

1、群勃龍醋酸酯(17β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one17-acetate)是一種高效的甾類蛋白同化激素,它從20世紀70年代開始便在美國被作為促生長劑用于農場牲畜。群勃龍醋酸酯在體內釋放后,便在動物血液中被迅速地水解成17β-群勃龍(17β-trenbolone,17β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one)。17β-群勃龍與雄激素有著類似的結構,且是一種有效的雄激素受體(AR)

2、激動劑。人類與17β-群勃龍的可能接觸途徑有以下幾種:(1)有意注射。作為一種同化類雄激素類固醇,群勃龍被健身者作為用來增加肌肉和力量的藥品。在已經發(fā)表的調查結果中,群勃龍是最受歡迎的注射藥物之一。多數(shù)注射者為業(yè)余健身愛好者,他們以較大的劑量長期注射群勃龍。(2)食用肉殘留。(3)食物鏈富集。17β-群勃龍被牲畜和人排出體外后,飼養(yǎng)場的廢水、飼養(yǎng)場旁邊的河流以及城市污水排放的下游均可能被17β-群勃龍污染,而且飼養(yǎng)場的糞便常被用作農田的

3、肥料。17β-群勃龍在環(huán)境中性質穩(wěn)定,具有較長的半衰期(在糞水中半衰期為260天)。17β-群勃龍可以進入水生生物和植物體內,經過食物鏈的層層累積,最終可能進入到人體內。(4)可能的臨床應用。雖然17β-群勃龍與內源雄激素睪酮(T)及二氫睪酮(DHT)結構類似,但是其不能被5α-還原酶還原,也不能被芳香化,它所引起的雄激素樣和/或雌激素樣的副作用比一般的雄激素給藥產生的副作用要小,因此17β-群勃龍作為藥物與T及DHT相比有明顯的優(yōu)勢。

4、目前已有研究考慮將其應用于臨床治療。
　　因為17β-群勃龍是一種合成的雄激素,因此對其生殖毒性的研究一直都是熱點,其它方面較少有人研究。目前的研究主要采用動物模型研究17β-群勃龍的生殖毒性。17β-群勃龍的生殖毒性包括破壞下丘腦-垂體-性腺軸(HPG axis)、干擾動物體內源激素的水平及影響動物生殖器官的發(fā)育和生殖能力。17β-群勃龍既會引起不同物種中雌性個體的雄性化,也可能會使發(fā)育中的雄性個體去雄性化。17β-群勃龍的神經

5、毒性尚未見報道。在神經退行性病變(如阿爾茨海默癥,AD)的發(fā)病機理中,除了遺傳因素,環(huán)境因素也起著至關重要的作用。中樞神經系統(tǒng)(CNS)是內源雄激素的重要作用靶點之一,而17β-群勃龍作為一種合成雄激素也有可能作用于神經系統(tǒng)。
　　本研究分別用動物實驗和細胞培養(yǎng)實驗研究17β-群勃龍的神經毒性作用。在動物實驗中,將17β-群勃龍經肌肉注射給正常成年Wistar大鼠及孕鼠,17β-群勃龍的注射劑量分別為0.2、1、5 mg/kg體重

6、,藥物處理時間為0.5、2、6、12、24、48 h。檢測大鼠腦組織、肌肉、血液及腦脊液(CSF)中17β-群勃龍的濃度及β-淀粉樣蛋白42(Aβ42)的水平,并分析大鼠血清激素水平的變化。在細胞培養(yǎng)實驗中,研究了1-100nmol/L濃度的17β-群勃龍對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經元的影響,包括對其細胞活力、神經元凋亡的影響,及對AD相關蛋白早老素-1(PS1)和Aβ42的影響,探索了AR和雌激素受體(ER)及基因組效應和非基因組效應在17

7、β-群勃龍的作用中所扮演的角色。
　　主要實驗結果如下:
　　1.17β-群勃龍可以穿過大鼠血腦屏障,聚集于大腦,尤其是海馬中。當17β-群勃龍注射劑量分別為0.2、1、5mg/kg體重時,在給藥48h后海馬中17β-群勃龍的濃度分別為:雄鼠5.42±0.27、6.12±0.21、7.03±0.17ng/g,雌鼠2.07±0.10、2.99±0.39、6.43±0.55ng/g。相對應的除海馬外剩余腦組織中的17β-群勃龍濃

8、度分別為雄鼠2.64±0.25、2.85±0.30、4.44±0.24ng/g,雌鼠1.55±0.20、1.89±0.22、3.74±0.26ng/g。雄鼠三個劑量組及雌鼠最高劑量組(5 mg/kg體重)中的海馬中17β-群勃龍的濃度均顯著高于對應的除海馬外剩余腦組織中的17β-群勃龍濃度。17β-群勃龍可以影響大鼠的血清激素水平,引起T、雌二醇(E2)及孕酮(PROG)水平的波動。17β-群勃龍也可以穿過胎盤屏障,并可在胎鼠腦中檢出。

9、給予孕鼠注射5 mg/kg體重的群勃龍48h后,胎鼠腦中17β-群勃龍的濃度為2.59±0.21ng/g。17β-群勃龍可以引起雄性大鼠腦及海馬中Aβ42的過量積累,胎鼠腦中Aβ42也顯著增加。
　　2.為更好地研究17β-群勃龍對海馬損傷的機制,本研究采用原代培養(yǎng)的海馬神經元作為實驗對象,進行體外實驗。發(fā)現(xiàn)17β-群勃龍對原代培養(yǎng)的海馬神經元有細胞毒性作用,可以引起細胞活力下降,引起其形態(tài)學改變、染色質凝集、凋亡小體形成、磷脂酰

10、絲氨酸外翻、線粒體膜電位下降及caspase-3活力的增強。說明17β-群勃龍可以引起海馬神經元的凋亡。17β-群勃龍能夠抑制T對神經元的神經保護作用。研究中采用不同的激動劑和抑制劑處理,探究17β-群勃龍的細胞毒性作用機制。17β-群勃龍使原代培養(yǎng)的海馬神經元caspase-3活性及Aβ42產生增加,并引起PS1蛋白表達水平的下降,這三種過程均是AR和ER依賴性的,其作用過程同時有基因組效應和非基因組效應的參與。
　　大鼠血清激

11、素水平的改變表明其HPG axis可能受到影響。當孕鼠接觸17β-群勃龍時,子代個體的CNS在胎兒時期可能就已經受到損傷。腦中Aβ42的增加將會影響胚胎CNS的正常發(fā)育及神經元的正常功能。根據(jù)文獻中所提到的生殖毒性在子代出生后的發(fā)育過程中顯現(xiàn)出來的結果,CNS所受的損害可能是不可逆轉的。海馬在學習和記憶等行為中發(fā)揮著重要作用,17β-群勃龍在海馬中的累積及其對海馬神經元的細胞毒性作用可能會產生嚴重的后果,如認知障礙、記憶損傷等,這些癥狀

12、最后會引發(fā)癡呆。17β-群勃龍具有神經毒性,可以引起海馬神經元凋亡,影響AD相關蛋白Aβ42和PS1的表達,它在神經退行性病變中起到了一定
　　的作用。目前17β-群勃龍作為一種同化類雄激素類固醇被健身愛好者廣泛使用,其使用劑量、使用周期、使用時間長短等應當受到監(jiān)管。另外,17β-群勃龍是一種環(huán)境雄激素,使除了健身愛好者之外的更多的人也處在暴露于17β-群勃龍的危險中。神經退行性病變(如AD)的發(fā)病是受基因因素和環(huán)境因素共同影響的

13、。目前大量的人力、物力、財力都放在了對基因因素的研究上,但是相當多的AD病人并沒有攜帶如PS1、APP等的突變基因,因此環(huán)境因素在AD的發(fā)病中扮演著重要的角色。因為CNS是激素作用的重要靶點之一,因此該研究的意義不只在于對17β-群勃龍毒性作用的發(fā)現(xiàn)。環(huán)境激素在我們的生存環(huán)境中無處不在,它們有著與人體內源激素相似的結構和/或性質,因此它們對神經系統(tǒng)的影響值得關注。發(fā)現(xiàn)這些危險因素并采取預防措施,將對延緩神經退行性病變有重要意義。

14、　　本文主要創(chuàng)新點:
　　1.給成年大鼠肌肉注射17β-群勃龍后,17β-群勃龍會分布于腦中,尤其是海馬中。給孕鼠注射后,可以在胎鼠腦中檢出17β-群勃龍。神經組織是17β-群勃龍的一個作用靶點。
　　2.17β-群勃龍有神經毒性,會引起原代培養(yǎng)的海馬神經元凋亡,引起AD相關蛋白Aβ42和PS1的表達水平變化。由神經元產生的Aβ42的增加,而PS1的蛋白表達水平下降,并且這些過程由激素受體介導。
　　3.17β-群勃龍