胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的作用及機(jī)制.pdf

1、背景和目的:
　　妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy, ICP）易導(dǎo)致胎兒急性宮內(nèi)窘迫甚至突然死亡，其病理生理機(jī)制不明，常規(guī)的產(chǎn)前監(jiān)測(cè)無(wú)法預(yù)測(cè)。故進(jìn)一步研究ICP病理生理機(jī)制，認(rèn)識(shí)ICP導(dǎo)致胎兒死亡的原因，是預(yù)防ICP不良妊娠結(jié)局的關(guān)鍵。
　　我們的前期研究發(fā)現(xiàn)ICP死胎的胎盤小血管中存在血栓及再通形成的現(xiàn)象，故提出假說(shuō):ICP孕母血液中升高的膽酸引起了胎盤血管內(nèi)

2、皮細(xì)胞功能障礙，促使血栓形成，微循環(huán)障礙，嚴(yán)重影響母胎氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換，引起胎兒急性宮內(nèi)窘迫甚至發(fā)生胎兒死亡。即ICP死胎的發(fā)生可能與膽酸引起的胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有關(guān)。
　　為驗(yàn)證上述假說(shuō)，我們進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):①觀察ICP胎盤組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化;②免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ICP與正常胎盤自噬相關(guān)蛋白LC3A/B與血栓形成相關(guān)蛋白vWF的表達(dá);③利用體外細(xì)胞模型觀察膽酸對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　材料與方法:
　　

3、1.體內(nèi)試驗(yàn):
　　①ICP胎盤組織學(xué)觀察:收集1999年1月～2012午12月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科收藏的有完整臨床資料的ICP死胎的胎盤的檔案蠟塊13例，設(shè)為ICP死胎組。選擇浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院活胎分娩的孕婦共40例，其中ICP胎兒活產(chǎn)孕婦20例（ICP活胎組），健康孕婦正常分娩20例為正常妊娠組。光學(xué)顯微鏡下觀察各組胎盤組織石蠟切片的HE染色玻片，統(tǒng)計(jì)各組胎盤梗死、合體結(jié)節(jié)細(xì)胞增多、絨毛干血管血栓形成及

4、再通發(fā)生的比例。
　?、贗CP胎盤超微結(jié)構(gòu)觀察:應(yīng)用透射電鏡掃描觀察ICP活胎組與正常妊娠組人胎盤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變。
　?、勖庖呓M織化學(xué)法研究:根據(jù)前期結(jié)果，通過(guò)免疫組化法檢測(cè)ICP與正常胎盤自噬相關(guān)蛋白LC3A/B與血栓形成相關(guān)蛋白vWF的表達(dá)。
　　2.細(xì)胞模型研究
　?、儆貌煌瑵舛忍荻?0～100uM)的甘膽酸處理人血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)24小時(shí)。
　?、谕干潆婄R掃描觀察甘膽酸處

5、理的HUVEC超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　③通過(guò)蛋白免疫印跡方法檢測(cè)HUVEC自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ與beclin-1的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.ICP胎盤組織學(xué)變化:
　?、僬Ｈ焉锝M2例有局灶性合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增多，未見(jiàn)到梗死、底蛻膜血腫及血栓形成。
　?、贗CP活胎組20例胎盤病理檢查，其中10例有局灶性合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增多，7例有梗死，4例見(jiàn)到底蛻膜血腫，1例見(jiàn)到絨毛膜下血栓。
　?、跧CP死胎組13例胎

6、盤病理檢查均有局灶性合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增多，其中5例可見(jiàn)梗死伴有小區(qū)鈣化、絨毛退行性交，5例遠(yuǎn)端絨毛干血管中可見(jiàn)血栓形成及再通。
　　2.ICP胎盤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化:
　　正常組胎盤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)W-P小體與大量彈力纖維;ICP活胎組胎盤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)亦可見(jiàn)到W-P小體與大量彈力纖維，同時(shí)可見(jiàn)到自噬小體明顯增多，并有向血管腔內(nèi)分泌的趨勢(shì)。
　　3.ICP胎盤自噬相關(guān)蛋白LC3 A/B與血栓形成相關(guān)

7、蛋白vWF的變化
　　(1) LC3蛋白主要表達(dá)于胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管壁平滑肌細(xì)胞及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的胞漿。正常妊娠組胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)較弱或者不表達(dá)。與正常妊娠組比較，ICP活胎組、ICP死胎組胎盤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，LC3蛋白表達(dá)遞次增加，三組間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　(2) vWF因子主要表達(dá)于胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿，正常妊娠組胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)較弱。與正常妊娠組比較，ICP活胎組、ICP死

8、胎組胎盤組織中vWF因子表達(dá)明顯增加，三組間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。ICP死胎組可見(jiàn)絨毛干的血管中，VWF因子在血栓形成并再通的血管內(nèi)皮細(xì)胞上強(qiáng)表達(dá)。
　　(3)胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞LC3A/B與VWF的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.65，P＜0.001)。
　　4.甘膽酸對(duì)HUVEC超微結(jié)構(gòu)的影響:
　　用100 uM甘膽酸與HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，透射電鏡掃描觀察到HUEVC細(xì)胞內(nèi)自噬小體較對(duì)照組明顯增

9、多。
　　5.甘膽酸對(duì)HUVEC細(xì)胞LC3B-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)的影響。
　　不同濃度(0～100uM)的甘膽酸作用24小時(shí)后，HUVEC的LC3B-Ⅱ、Beclin-1表達(dá)量隨甘膽酸濃度的增加而逐漸增加。其中100uM組LC3B-Ⅱ的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.ICP死胎組胎盤血管存在血栓及再通現(xiàn)象，提示血栓形成可能是ICP胎兒窘迫甚至死胎發(fā)生時(shí)胎盤重要的病理變化之一。