1,25-二羥維生素D3對HaCaT細胞增殖活性的影響及其表觀遺傳調控機制研究.pdf

1、目的:通過1，25-二羥維生素D3(1，25(OH)2D3)處理人表皮角質細胞株HaCaT細胞后，檢測HaCaT細胞增殖活性、基因組總體甲基化水平、DNA甲基化修飾相關基因表達水平、細胞增殖和凋亡相關基因PDCD5和TIMP2表達及其啟動子甲基化水平的變化，初步揭示維生素D3治療銀屑病的表觀遺傳學調控機制，為尋找銀屑病治療的新靶點提供實驗依據(jù)。
　　 方法:1.HaCaT細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。接種細胞融合

2、達70％，培養(yǎng)基中分別加入10-6M、10-7M、10-8M的1，25(OH)2D3處理細胞24小時;
　　 2.使用MTT細胞增殖試驗檢測不同濃度1，25(OH)2D3對HaCaT細胞增殖活性的影響;
　　 3.不同濃度1，25(OH)2D3處理HaCaT細胞后，基因組DNA提取試劑盒提取細胞基因組DNA，Trizol法提取細胞總RNA;
　　 4.應用整體甲基化定量試劑盒檢測1，25(OH)2D3組和陰性對照

3、組HaCaT細胞基因組DNA總體甲基化水平;
　　 5.實時定量聚合酶鏈反應(quantitativereal-timePCR，RT-qPCR)檢測DNA甲基轉移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)、甲基結合蛋白(MethylBindingDomainProteins，MBDs)、PDCD5和TIMP2的mRNA水平;
　　 6.甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR，

4、MS-PCR)檢測PDCD5和TIMP2的啟動子區(qū)DNA甲基化水平。
　　 結果:1.與陰性對照組比較，10-6M1，25(OH)2D3處理組HaCaT細胞增殖活性及DNA整體甲基化水平明顯降低(P＜0.05)。
　　 2.Real-timePCR結果顯示:與陰性對照組相比，HaCaT細胞甲基轉移酶DNMT1基因mRNA水平在10-6M和10-7M濃度1，25(OH)2D3處理組無明顯改變。然而甲基轉移酶DNMT3a和D

5、NMT3bmRNA較對照組轉錄水平明顯下降，其中DNMT3a在10-6M組改變具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。甲基結合蛋白MeCP2與MBD2在各濃度組mRNA轉錄水平均顯著上調(P＜0.05)。MBD1基因在10-6M組mRNA轉錄水平顯著下調(P＜0.05)，10-7M組轉錄下調不明顯。MBD3、MBD4mRNA在10-6M組無明顯差異，但MBD3基因mRNA在10-7M組明顯上調(P＜0.05)。DNMTs和MBDs基因mRNA水

6、平在低濃度10-8M濃度組表達水平均顯著升高(P＜0.05)。
　　 3.Real-timePCR結果顯示:與陰性對照組相比，PDCD5和TIMP2mRNA轉錄水平在10-6M濃度組明顯上調(P＜0.05)。MS-PCR檢測結果顯示:與陰性對照組相比，PDCD5和TIMP2基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平明顯降低(P＜0.05)。
　　 結論:1，25(OH)2D3通過抑制DNA甲基化轉移酶DNMT3a和DNMT3b的表達，