骨髓基質干細胞復合幾丁質凝膠體外聯(lián)合培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、可注射性水凝膠是國際上近幾年興起的一種相對新穎的軟骨組織工程材料，它提供了一類新的細胞固定機制，可注射性材料用于軟骨缺損修復的優(yōu)勢在于材料與修復細胞之間嵌合連接好、塑形容易，細胞和生長因子能與材料充分均勻混合，且能通過關節(jié)鏡或其它微創(chuàng)方式操作，安全、有效、費用低。本實驗利用可注射性水凝膠——幾丁質作為骨髓基質干細胞載體，在體外進行聯(lián)合培養(yǎng)，為構建組織工程軟骨組織提供實驗依據(jù)。 材料與方法： 1實驗動物成年SD大鼠10只，

2、雄鼠體重120-140g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。 2主要試劑和儀器幾丁質(SIGMA公司)，DMEM(GIBCO公司產品)，新生牛血清(GIBCO公司產品)，percoll梯度分離液(PHARMACIA公司產品密度：1.073g/m)，胰島素樣生長因子IGF-I、轉化生長因子TGF-β1(Sigma公司)、維生素C、地塞米松，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡。 3幾丁質凝膠的制備在10℃下，將幾丁質(SIGMA公司)1

3、0g放入研缽中，加丙酮40ml研磨10min；邊研磨邊緩緩加入冷濃HCl400ml，充分研磨，使呈糊狀.于4℃放置24h，之后用玻璃棉過濾，將濾液緩緩加入到盛有2000ml體積分數(shù)50％乙醇的燒杯中，邊加邊劇烈攪拌，然后靜置，待膠態(tài)幾丁質析出后去除清液，收集膠態(tài)幾丁質；用蒸餾水沖洗膠態(tài)幾丁質至pH7，以蒸餾水定容至1000ml，冷藏備用. 4BMSCs的分離，培養(yǎng)及鑒定實驗動物，用4％的戊巴比妥鈉麻醉后，在無菌條件下抽取股骨骨髓

4、(抗凝處理)，用DMEM倍比稀釋(1:1)，緩慢加入預先準備好的含percoll梯度分離液的試管中，1200r/min，離心20min，收取單個核細胞的界面層，DMEM洗滌，反復2次，加入含10％新生牛血清/DMEM的24孔板內，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，48小時去除未黏附細胞，亦更換培養(yǎng)液，隔天換液，0.25％胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)。OLYMPUS倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長情況。待原代骨髓干細胞增殖貼壁成單層后

5、，收集細胞。取部分細胞進行堿性磷酸酶染色，茜素紅染色和Mallory染色。 5傳代培養(yǎng)、誘導、鑒定 取第四代細胞分為三組，實驗組按1×105接種于24孔培養(yǎng)液，分別加入2mlDMEM無血清特定培養(yǎng)液(地塞米松0.4mg/L，TGF-β110ng/ml、IGF-I50ng/50ul，維生素C50ng/L)，并與2倍量幾丁質凝膠混勻，培養(yǎng)誘導；對照組以同樣濃度接種于24孔培養(yǎng)板，加入同樣DMEM無血清特定培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導；空白

6、對照組同樣濃度接種于24孔培養(yǎng)板單純培養(yǎng)。內置玻片，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周2次換液。倒置顯微鏡觀察，分別在誘導后7、14、21d取出載玻片，免疫組化檢測BMSCS分化的軟骨細胞分化的Ⅱ型膠原以及HE染色和阿爾新藍染色。 6透射電鏡觀察收集原代BMSCs細胞和經培養(yǎng)誘導14dBMSCs細胞，于1.5ml離心管中，2％戊二醛固定24h，常規(guī)超薄切片透射電鏡觀察細胞超微形態(tài)。 7Ⅱ型膠原的含量分析聯(lián)合培養(yǎng)7，1

7、4，21d隨機取免疫組化染色切片，每組20張。在Linzux成像系統(tǒng)下對免疫組化結果進行檢測，測量其輝度，計算百分比。 8統(tǒng)計學處理用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，差異性顯著性采用t檢驗。 結果： 1電鏡檢查透射電鏡下，細胞表面的褶皺狀小突起是軟骨細胞超微結構重多特征之一?？梢妼嶒灲M軟骨細胞呈圓形或橢圓形，具有典型的褶皺狀小突起，胞漿內粗面內質網數(shù)量很多，排列緊密，內質網池略多為擴張，充滿顆粒物質

8、，線粒體少，核內常染色體增多。對照組軟骨細胞較小且少，成梭形。 2組織學檢測HE染色：BMSCs傳代第四代后，細胞外形呈現(xiàn)短柱狀及三角狀，胞核呈淡紅色。聯(lián)合培養(yǎng)后細胞形態(tài)變短，呈四方形，表現(xiàn)為“鋪路石”樣排列，阿爾新蘭染色示細胞外基質分泌旺盛，呈堿性基質，染蘭色。 3Ⅱ型膠原的免疫組化檢測實驗組在培養(yǎng)中7，14，21dBMSCs誘導分化的軟骨細胞分泌的Ⅱ型膠原免疫組化均為陽性，可見標黃色的顆粒分布于細胞漿內?；|染色較對

9、照組更為明顯。 4Ⅱ型膠原的含量分析見表1。討論利用組織工程學方法構建透明軟骨來修復關節(jié)軟骨缺損是骨科領域正在積極探討的課題。 組織工程的研究主要包括三個方面：種子細胞的離體培養(yǎng)、細胞外基質替代物、生物材料的研究及組織工程化的組織的構建。骨髓基質干細胞因其來源不受限，取材方便，對供體損傷小，易于分離培養(yǎng)，體外增殖能力強，大量傳代培養(yǎng)后仍具成軟骨能力；同時，BMSCs具有多潛能性，根據(jù)環(huán)境而有不同的分化路途，在各自解剖位置

10、，分別形成透明軟骨、軟骨下骨，而且BMSCs易于基因修飾調整，用于表達所需的細胞因子，所以BMSCs作為軟骨組織工程的一種重要的種子細胞越來越被人們所重視。同時，獲得優(yōu)良的組織工程軟骨與支架性質的優(yōu)劣是分不開的。 可注射性水凝膠是一種相對新穎的軟骨組織工程材料，其優(yōu)勢在于材料與修復組織之間嵌合連接好，塑形容易，細胞和(或)生長因子與材料充分均勻混合，且能通過關節(jié)或其它微創(chuàng)方式操作，治療簡單、安全、有效、費用低，不會遺留明顯瘢痕，

11、同時凝膠樣材料適合于對細胞施加壓力，凝膠的應變力對細胞產生應力刺激。 幾丁質是一種天然生物高分子多聚糖，具有良好的生物相溶性和生物降解性，所有降解產物對人體均無毒性、無刺激、無免疫原性，無致突變效應，且該材料具有廣譜抑制細菌、霉菌的作用。 本實驗中BMSCs在幾丁質凝膠中表現(xiàn)出良好的生存能力、黏附性、增殖能力和再分化，經軟骨的誘導后，透射電鏡下細胞具有典型的褶皺狀小突起，細胞器發(fā)達，表現(xiàn)出軟骨細胞良好的表型。HE染色，細

12、胞成圓形或橢圓形，阿爾新蘭染色細胞外基質分泌旺盛。Ⅱ型膠原免疫組化檢測，實驗組均為陽性，可見棕黃色顆粒分布于細胞漿，以軟骨細胞周圍明顯，成條索狀分布，與周圍組織分界明顯，基質染色較對照組更為明顯。Ⅱ型膠原含量分析，實驗組明顯優(yōu)于對照組(p＜0.05)。 實驗證明，可注射性幾丁質水凝膠能為BMSCs向軟骨誘導分化提供所需的三維空間，有利于BMSCs向軟骨細胞定向分化及細胞外基質合成。同時，其具有的取材廣泛、安全性高、廣譜的抑菌作用