結核分枝桿菌cAMP誘導基因Rv1265在胞內存活中的作用與分子機理.pdf

1、據2013 World Health Organization Tuberculosis Data and Statistics報道，結核病每年導致1.3 million死亡，新增8.6 million感染病例。由于藥物的廣泛濫用及亂用，使得結核病死灰復燃，嚴重危害著人類的健康，尤其是與HIV免疫缺陷病人共感染。多重耐藥菌（mutiple-drug resistance）和廣泛耐藥菌(extensive-drugresistance)的

2、出現(xiàn)使得結核病的治療更加困難。因此尋找結核分枝桿菌的新的藥物靶標，篩選并開發(fā)新型抗結核藥物。目前結核分枝桿菌存在許多功能未知的保守蛋白，而這些蛋白對于結核分枝桿菌在宿主中的存活是否存在一定關聯(lián)，這些都需要做進一步的探討。因此本文主要以恥垢分枝桿菌為模型，探索cAMP應答基因rv1265在結核分枝桿菌毒力中的作用。
　　本研究成功構建了重組質粒pALACE-Rv1265，將其電轉到恥垢分枝桿菌后通過抗生素篩選和菌液PCR的方法鑒定重

3、組菌株Ms_Rv1265構建成功。以實驗室現(xiàn)存的空載菌株Ms_vector為對照，western blotting成功檢測到Ms_ Rv1265菌株中帶有His標簽的Rv1265蛋白表達，而空載菌(Ms_Vec)在相應的位置上沒有條帶。利用96孔板檢測Rv1265的過表達菌株對臨床上常用的抗結核藥物的耐受情況，發(fā)現(xiàn)與Ms_ Vec相比Ms_ Rv1265對抗生素的耐受性并沒有影響。生長曲線測定發(fā)現(xiàn)Ms_Rv1265和Ms_Vec的生長沒

4、有差異，說明Rv1265的過表達不會影響恥垢分枝桿菌的生長。細胞亞定位發(fā)現(xiàn)Rv1265蛋白定位在重組菌的細胞壁和細胞質中，推測該蛋白可能會改變重組菌的細胞壁性質。因此我們提取Ms_Rv1265和Ms_Vec的脂肪酸，發(fā)現(xiàn)重組菌細胞壁的脂肪酸含量明顯高于空載菌，尤其是C10∶0，MeC13∶0, MeC14∶0, C15∶0, MeC15∶0, C16∶1We7(c), MeC16∶0,3MeC16∶0, C24∶1W9(c)和C26∶0

5、的含量顯著性上調，據此我們推測Rv1265可能參與了恥垢分枝桿菌脂肪酸的合成。C26∶0是分枝菌酸高溫分解的產物之一，而重組菌中C26∶0的增多也可能是因為重組菌中分枝菌酸的含量增多引起的。體外模擬重組菌Ms_Rv1265和Ms_ Vec在表面活性物質SDS和不同酸性條件下的存活，發(fā)現(xiàn)重組菌在0.1％ SDS處理下具有較強的存活率，并且相對于空載菌具有顯著性差異。在PH=3的7H9培養(yǎng)基里培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)與Ms_Vec相比，Ms_Rv1265

6、具有較強的存活率，而在PH=5的條件下，兩者沒有顯著性差異。為了進一步探索Rv1265蛋白的毒力作用，利用Ms_Rv1265和Ms_ Vec侵染THP-1細胞和Raw264.7細胞，發(fā)現(xiàn)Ms Rv1265在巨噬細胞內的存活能力相對于Ms_ Vec具有顯著性提高，LDH釋放量檢測發(fā)現(xiàn)與Ms_Vec相比Ms_ Rv1265可以促進THP-1巨噬細胞的裂解。同時提取Raw264.7和THP-1細胞的總RNA，檢測相關的細胞因子IL-1β， I

7、L-6， IL-10，IL-12P40和TNF-a，以及炎癥相關的caspase-1和促凋亡因子bcl-rambo的轉錄水平。發(fā)現(xiàn)與Ms_Vec相比Ms_ Rv1265侵染后在Raw264.7和THP-1細胞中細胞因子IL-1β，IL-12P40，IL-10和IL-6均上調表達。利用特異性的信號通路抑制劑處理侵染了Ms_ Rv1265和Ms_ Vec的細胞THP-1，發(fā)現(xiàn)NF-κB和1/2ERK途徑對于特異性誘導IL-1β，IL-12P