結(jié)核分枝桿菌Rv0394c蛋白在粘附肺泡上皮細胞中的作用研究.pdf

1、結(jié)核病是危害人類和動物的重大傳染病之一，尤其是近年來隨著多重耐藥分枝桿菌的出現(xiàn)以及與病毒的混合感染，使得對結(jié)核病的治療變得越來越困難。因此，研究結(jié)核病的致病機理、研發(fā)新型高效的結(jié)核病疫苗已成為當務之急。結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白是引發(fā)疾病的重要毒素或逃避機體免疫系統(tǒng)的工具，盡管已經(jīng)證明了結(jié)核分枝桿菌的幾個分泌蛋白（Ag85b、ESAT-6等）為重要毒力因子，但該病原致病機理以及免疫逃避的分子機制尚不明確。
　　本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，

2、結(jié)核分枝桿菌rv0394c基因的編碼蛋白Rv0394c(SEC)含有跨膜區(qū)，預測SEC蛋白可能為一種分泌型蛋白，且rv0394c基因僅存在于致病性的分枝桿菌如結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌中，因而可能與分枝桿菌致病性相關(guān);SEC蛋白具有透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素酶活性，其作用底物是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的主要成分，屬于糖胺聚糖類大分子物質(zhì)，且透明質(zhì)酸廣泛存在于多種細胞表面，推測SEC蛋白可能在分枝桿菌粘附宿主細胞的過程中發(fā)揮重要作用。為了驗

3、證這一推測，我們開展了以下實驗研究。
　　本研究首先利用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得了重組SEC蛋白，經(jīng)親和層析純化后免疫小鼠，采用細胞融合、克隆和篩選等技術(shù)，制備了針對該蛋白的單克隆抗體，作為后續(xù)實驗的檢測工具;通過間接ELISA檢測方法，證明了該蛋白具有與DNA和多糖等大分子物質(zhì)的結(jié)合特性;通過激光共聚焦顯微鏡，直觀地觀察到SEC蛋白粘附人肺泡上皮細胞(A549)的現(xiàn)象。為進一步驗證SEC蛋白與細胞的結(jié)合特性，我們將rv0394c基因

4、克隆至大腸桿菌-分枝桿菌穿梭載體pMV262中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMV262-sec，電轉(zhuǎn)化入恥垢分枝桿菌MC2155后獲得了組成型表達rv0394c基因的重組菌MS/SEC;利用A549為細胞模型與重組菌MS/SEC進行互作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與親本菌相比，重組菌MS/SEC粘附A549細胞的能力顯著提高，而這種粘附作用可被SEC蛋白以及抗該蛋白的特異性抗體所阻斷;以小鼠為動物模型，將重組菌經(jīng)鼻腔感染小鼠，定期檢測重組菌的定殖情況。結(jié)果表明，與親

5、本株相比，重組菌在小鼠肺部的定殖能力增強，且能造成肺部組織一定程度的病理變化，而加入外源透明質(zhì)酸則可以促進重組菌的清除。此外，通過Western Blot方法檢測SEC蛋白在分枝桿菌各亞細胞組分中的分布情況，結(jié)果表明，該蛋白主要存在于胞壁，為一種表面錨定蛋白，這也為證明其在分枝桿菌粘附細胞過程發(fā)揮作用提供了更充分的證據(jù)。
　　綜上所述，本研究首次制備了抗結(jié)核分枝桿菌SEC蛋白的單克隆抗體，為進一步研究結(jié)核分枝桿菌SEC蛋白的結(jié)構(gòu)和