呼吸道合胞病毒感染對大鼠脊髓背根神經節(jié)轉錄因子活性的影響.pdf

1、目的：在研究RSV感染后氣道神經源性炎癥和氣道神經可塑性致氣道高反應性的基礎上，研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染后大鼠脊髓背根神經節(jié)神經元轉錄因子的表達變化，篩選可能與氣道神經可塑性相關的轉錄因子，進一步從細胞內信號轉導和轉錄調控機制深入探討氣道神經可塑性的細胞內調控機制，闡明氣道神經可塑性導致氣道高反應性和哮喘的機理，為哮喘的防治探索一條新的途徑。 方法：RSV病毒株接種于鋪滿單層Hela細胞的細胞培養(yǎng)瓶中，待病變達100％時

2、收獲病毒。-70℃保存?zhèn)溆?。收集無病毒的Hela單層細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基上清液和細胞溶解產物，從而獲得病毒基質作為陰性對照。進行感染性(50％組織細胞發(fā)生病變的感染劑量即TCID50/0.1ML)的測定(毒力測定)。1-2周齡SD大鼠(湖南省農業(yè)大學動物部)隨機區(qū)組分為2組，每組30只.1組：空白對照組；2組:RSV感染組①對照組(30只)，用2％戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，每一個鼻孔內滴入0.4ul/g無病毒培養(yǎng)基。②RS

3、V感染組(30只)，用2％戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，在每一個鼻孔內滴入0.4ul/g滴度為5X104TCID50/0.1ML的RSV病毒懸液。以上操作每周重復一次。兩組第8周按編號后抽簽方法將其中5只大鼠進行氣道反應性測定，氣道反應性測定后，取左肺，HE染色觀察病理改變，行免疫組化染色檢測，在冰面上迅速剖取脊髓背根神經節(jié)C7-T5于凍存管中，保存于液氮中。原位雜交法檢測肺組織RSV蛋白的存在，免疫組化檢測氣道、神經節(jié)SY

4、N、NF的表達，用轉錄因子活性芯片初步篩選調控氣道神經可塑性的信號轉錄因子,western blot檢測EGR-1在肺組織和脊髓背根節(jié)的表達變化。 結果：(1)實驗組大鼠漸出現卡他性鼻炎、呼吸氣促、毛亂、活動度降低的臨床表現，實驗組大鼠與對照組大鼠在平均體重差異無顯著性，體溫差異有顯著性(P<0.05)。(2)實驗組大鼠吸入梯度濃度組胺后氣道阻力明顯高于正常對照組，差異有顯著性(均P<0.05)，說明存在氣道高反應性。(3)光鏡

5、下實驗組大鼠肺組織符合典型間質性肺炎的病理改變。(4)實驗組氣道壁、神經節(jié)中SYN、NF蛋白表達平均陽性系數顯著高于對照組(P<0.05)。(5)利用TranSignal蛋白/DNA組合芯片(345)檢測篩選：RSV反復感染引起大鼠C7-T5背根節(jié)345個轉錄因子中的55個表達上調2倍以上，43個表達下調2倍以上。(6)western blot檢測EGR-1在肺部和脊髓背根節(jié)細胞的表達變化，結果顯示EGR-1在RSV感染組表達明顯低于對