廣譜脫氧核酶抗不同免疫功能小鼠呼吸道合胞病毒感染的研究.pdf

1、背景和目的 呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvires，RSV)是全世界嬰幼兒下呼吸道感染首位病毒病原體，人群普遍易感，早產(chǎn)兒、骨髓移植病人、先天性心臟病以及免疫功能不全患者等高危人群常發(fā)生嚴(yán)重感染甚至死亡。RSV有A、B兩個(gè)抗原亞型，各亞型有眾多病毒株，是高度變異的RNA病毒，初次感染通常不產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用，易于再感染，病毒變異給預(yù)防和治療帶來(lái)困難，目前尚無(wú)安全有效的RSV疫苗和抗病毒藥物問(wèn)世。

2、 10一23型脫氧核酶(Deoxyribozyme，DNAzyme，DZ)是體外篩選獲得具有特異性RNA切割活性的DNA分子，是新型的基因治療工具，已用于感染、腫瘤、遺傳代謝等疾病的研究，可有效抑制靶基因表達(dá)。我們?cè)谇捌谘芯恐校槍?duì)RSV基因組或mRNA設(shè)計(jì)多種脫氧核酶，篩選出有效抗RSV的DZ604、DZ8269和DZll33，其中DZ¨33是以RSV生活周期中起重要作用的N蛋白基因的保守序列為靶點(diǎn)，抑制A、B兩個(gè)亞型RSV在感

3、染細(xì)胞中的復(fù)制。本研究在正常和免疫缺陷小鼠建立RSV感染模型，研究DZ¨33對(duì)RSV感染不同免疫功能小鼠的保護(hù)作用；研究DZ¨33在小鼠體內(nèi)對(duì)RSVA、B兩個(gè)亞型標(biāo)準(zhǔn)株和地方分離株的廣譜抗病毒作用；比較針對(duì)RSV相同靶序列的脫氧核酶DZ¨33和反義寡核苷酸(Antisenseoligodeoxynucleotides，ASODN)AS1133以及抗RSV藥物利巴韋林在小鼠體內(nèi)的抗病毒效果；尋求在免疫功能正常和免疫缺陷個(gè)體內(nèi)，對(duì)A、B兩個(gè)

4、亞型標(biāo)準(zhǔn)株和地方分離株病毒都有效的廣譜抗RSV制劑。 方法 RSVA亞型標(biāo)準(zhǔn)株A2株、B亞型標(biāo)準(zhǔn)株CHl8537株和4株重慶、北京地方分離株病毒分別滴鼻感染BALB／c鼠，RSVA2株感染裸鼠，各治療組小鼠在感染后24h和48h分別給予不同劑量膽固醇連接和部分硫代修飾的DZ1133和AS¨33，以及利巴韋林滴鼻，未感染RSV、DZ¨33滴鼻的小鼠為陰性對(duì)照，感染后未治療的小鼠為感染對(duì)照，未經(jīng)任何處理的小鼠為空白對(duì)照。取感

5、染BALB／c鼠和裸鼠肺、肝、脾、腎組織進(jìn)行病毒分離。感染后不同時(shí)間空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各治療組和感染對(duì)照組BALB／c鼠和裸鼠肺組織病毒滴度，計(jì)算各治療組空斑形成抑制率。冰凍切片分析熒光標(biāo)記DZll33在BALB／c鼠肺組織分布，RT-PCR檢測(cè)肺組織RSVN基因、Tolllikereceptor4(TLR4)和TLR2mRNA表達(dá)，原位雜交檢測(cè)肺組織RSVmRNA表達(dá)和分布，直接免疫熒光檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中RSV抗原，免疫

6、組織化學(xué)檢測(cè)肺組織病毒抗原。BALF中白細(xì)胞及其分類計(jì)數(shù)、肺組織光鏡、電鏡病理學(xué)分析氣道炎癥。免疫組織化學(xué)檢測(cè)空白對(duì)照和感染BALB／c鼠和裸鼠肺組織CDl4+細(xì)胞和CD56+細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析外周血CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞比例，ELISA檢測(cè)血漿總IgE和BALF中細(xì)胞因子tNF-fl、IFN-~、IL．12和IL一10的水平。 結(jié)果 RSV感染BALB／c鼠和裸鼠肺組織分離到病毒，肝、脾、腎組織均未分離到病毒，兩

7、種小鼠肺組織病毒滴度高峰都在感染后第3天(PID3)，裸鼠在PID9病毒滴度仍較高，BALB／c鼠在PID7就檢測(cè)不到病毒。RSV感染BALB／c鼠和裸鼠BALF免疫熒光和肺組織免疫組化都檢測(cè)到RSV抗原，肺組織呈明顯間質(zhì)性炎癥改變。與空白對(duì)照BALB／c鼠和裸鼠比較，感染BALB／c鼠和裸鼠肺組織TLR4表達(dá)增強(qiáng)、血漿總IgE升高、肺組織CDl4+細(xì)胞和CD56+細(xì)胞數(shù)目增多，BALF中白細(xì)胞總數(shù)增加，以淋巴細(xì)胞為主，TNF-(I、I

8、FN-7、IL一12和IL-10水平升高。感染裸鼠與感染BALB／c鼠比較，肺組織RSV滴度和抗原表達(dá)更高，病理?yè)p害更重，BALF中白細(xì)胞數(shù)目和TNF-a、IL一12、IL一10水平更高，肺組織CDl4+細(xì)胞和CD56+細(xì)胞數(shù)目更多。感染BALB／c鼠血漿總IgE水平比感染裸鼠高，外周血CD4+淋巴細(xì)胞比例比空白對(duì)照BALB／c鼠升高。 滴鼻給予DZll33在BALB／c鼠肺組織中分布良好。DZ¨33治療組BALB／c鼠和裸鼠與

9、感染對(duì)照BALB／c鼠和裸鼠比較，肺組織病毒滴度降低，0．2mg、0．4mg和0．8mgDZ¨33治療的病毒空斑形成抑制率在PID3的BALB／c鼠是65．88％、78．06％和85．83％，裸鼠在PID3是91．92％、97．05和98．51％，PID6是91．61％、97．04％和98．05％。0．2mg、0．4mg和0．8mgDZ1133治療組BALB／c鼠肺組織RSVN基因mRNA表達(dá)下降率分別是30．51％、47．38％和53

10、．97％，相應(yīng)的治療組裸鼠病毒mRNA表達(dá)下降36．59％、48．72％和59．78％。DZ1133抗RSV作用隨劑量加大而增強(qiáng)。0．4mgDZ1133抑制感染BALB／c鼠和裸鼠肺組織原位雜交RSVmRNA的分布和表達(dá)，減少肺組織RSV抗原免疫組化的平均光密度，降低BALF中白細(xì)胞數(shù)，改善肺組織病理?yè)p害。 0．4mgDz1133處理的陰性對(duì)照BALB／c鼠和裸鼠沒有明顯肺組織病理改變，BALF中TNF—α和IFN—γ比空白對(duì)照

11、BALB／c鼠和裸鼠升高。 0．4mgDz¨33滴鼻降低6株不同RSV感染BALB／c鼠肺組織病毒滴度，包括RSVA亞型標(biāo)準(zhǔn)株A2株、B亞型標(biāo)準(zhǔn)株CHl8537株、重慶地區(qū)A亞型分離株CQ381513株和B亞型分離株CQ38¨70株、北京地區(qū)分離株BJ01株和BJ04株，與各自的感染對(duì)照組比較，各DZ¨33治療組肺組織病毒空斑形成抑制率分別是70．34％、73．29％、82．23％、81．97％、68．89％、71．45％，RS

12、VN基因mRNA表達(dá)下降率分別是48．89％、53．18％、74．83％、64．37％、43．57％、58．07％，肺組織RSV抗原免疫組化的平均光密度降低，肺組織充血水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，病理?yè)p傷減輕。 DZ¨33和AS1133滴鼻處理降低RSVA2株感染BALB／c鼠肺組織病毒滴度，與感染對(duì)照組比較，0．2mgDz¨33和AS1133治療組病毒空斑形成抑制率分別是65．88％和34．48％，0．4mgDz1133和AS¨3

13、3治療組抑制率分別是78．06％和46．75％，0．4mg利巴韋林治療組肺組織病毒滴度沒有明顯變化，0．8mg利巴韋林治療組病毒空斑形成抑制率為23．02％；0．4mgDZ¨33和AS¨33治療組肺組織RSVN基因mRNA表達(dá)分別下降47．38％和30．54％，RSV抗原免疫組化的平均光密度降低43．5％和31．06％，肺組織病理改變明顯改善；0．4mg利巴韋林治療組RSV抗原平均光密度下降28．71％，N基因mRNA表達(dá)和組織病理學(xué)改

14、變沒有顯著變化。 結(jié)論 1．RSV感染免疫功能正常的BALB／c鼠和細(xì)胞免疫缺陷的裸鼠有相似的病毒復(fù)制和炎癥反應(yīng)特點(diǎn)，裸鼠病毒復(fù)制水平更高、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。 2．RSV感染裸鼠的氣道炎癥反應(yīng)比感染BALB／c鼠更重。RSV感染的炎癥反應(yīng)程度與細(xì)胞免疫應(yīng)答不平行。 3．脫氧核酶DZ1133有效抑制BALB／c鼠和裸鼠體內(nèi)RSV復(fù)制，降低病毒基因和蛋白表達(dá)，改善氣道炎癥病理?yè)p傷，抗RSV作用隨劑量加大而增強(qiáng)，對(duì)