肝臟基質(zhì)微環(huán)境對免疫細胞分化和功能的調(diào)控作用及其機制研究.pdf

1、肝臟具有非常獨特的免疫系統(tǒng).一方面,在肝臟中存在多種淋巴細胞,包括T細胞,NK細胞,NKT細胞等,它們可以識別病原微生物和毒素,啟動免疫應(yīng)答以清除外來有害異物.另一方面,從小腸中吸收來的大量營養(yǎng)物質(zhì)通過門靜脈進入肝臟進行代謝,同時也帶來了大量無害的食物抗原,目前的研究表明,從門靜脈進入肝臟的抗原更容易誘發(fā)耐受,稱之為"門脈耐受現(xiàn)象". 因此,肝臟局部的免疫反應(yīng)需要非常精細的調(diào)節(jié),才能保證在特定的情況下正確選擇是啟動免疫應(yīng)答還是誘導(dǎo)免疫

2、耐受.而對于這種調(diào)節(jié)的機制,目前所知甚少.除了抗原進入的途徑不同外,肝臟中存在的多種免疫細胞也可以分布到全身其他地方,它們?yōu)楹卧诟闻K中既可以誘導(dǎo)免疫耐受,又可以激發(fā)免疫應(yīng)答?對這一問題的回答將研究的方向指向了肝臟的免疫微環(huán)境:此現(xiàn)象提示肝臟微環(huán)境具有獨特的功能,即可能通過對不同細胞的分化及功能進行調(diào)控,從而可以在免疫應(yīng)答和維持耐受中發(fā)揮著重要作用. 作為構(gòu)成肝臟器官微環(huán)境的重要組成部分,基質(zhì)細胞在維持肝臟器官形態(tài)、營養(yǎng)細胞、調(diào)節(jié)

3、器官內(nèi)細胞分化等多方面發(fā)揮重要作用.因而,我們選擇用肝臟基質(zhì)細胞來模擬肝臟微環(huán)境,觀察其對造血前體細胞或NK細胞的影響,希望可以在一定程度上反映肝臟微環(huán)境的效應(yīng),為深入闡明肝臟局部免疫反應(yīng)的精細調(diào)節(jié)提供新的視角. 首先,我們利用組織培養(yǎng)技術(shù)從新生小鼠肝臟中分離到肝臟基質(zhì)細胞,并對其細胞類型進行了鑒定.免疫組織化學(xué)的結(jié)果表明:分離到的肝基質(zhì)細胞胞內(nèi)表達 Vimentin 和Desmin,但不表達Cytokeratin-7, 亦不

4、分泌白蛋白;吞噬試驗的結(jié)果表明:該細胞不吞噬LDL;而RT-PCR的檢測結(jié)果則顯示:該細胞表達a-SMA 和多種基質(zhì)組份的mRNA,包括Ⅰ型膠原(al (I) collagen)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2,但不表達GFAP .從以上結(jié)果來看,該細胞具有肝臟內(nèi)成纖維母細胞的特性.成纖維母細胞是肝臟基質(zhì)細胞中的主要細胞類型之一,主要分布在肝臟的門脈部位.肝內(nèi)大部分樹突狀細胞的主要定居部位也是在肝臟門脈部位.因而,肝臟內(nèi)樹

5、突狀細胞獨特的功能及表型可能與其定居局部附近的肝臟基質(zhì)細胞形成的局部微環(huán)境有關(guān). 為研究肝臟免疫微環(huán)境對前體細胞分化的效應(yīng),我們將骨髓來源的造血前體細胞與分離的肝臟基質(zhì)細胞共育.結(jié)果發(fā)現(xiàn),肝臟基質(zhì)細胞能誘導(dǎo)前體細胞分化為一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的樹突細胞樣細胞 .從鏡下培養(yǎng)特性和染色后形態(tài)觀察:該細胞為髓樣細胞表現(xiàn),并伸出類似傳統(tǒng)意義上的DC(Conventional dendritic cells,cDCs)相似的樹突樣結(jié)構(gòu).流式

6、分析結(jié)果顯示:其表型特征為不表達 CD4、CD8a、B220、Gr-1、CD14和B7DC;但低水平表達CDllc、I-A<'b>、CD54、CD40、CD86;中高水平表達CDllb、CD80、B7H-1.cDCs最重要的功能是能將抗原遞呈給抗原特異性T細胞,并誘導(dǎo)其活化與增殖.故而,我們利用OVA<,323-339>特異性TCR轉(zhuǎn)基因鼠的CD4<'+>T細胞,對LRDCs的抗原遞呈功能進行了分析.發(fā)現(xiàn)LRDCs能將抗原遞呈給T細胞,

7、但不能有效地誘導(dǎo)CD4<'+>T細胞的增殖,僅能引起CD4<'+>T細胞一定程度的活化.另外,該細胞還呈現(xiàn)出較cDCs更強的吞噬功能.提示這是一群不同于cDCs的DC細胞. TLR(Toll-like receptors)是廣泛表達在免疫細胞表面的一類模式抗原識別受體,對于激活機體的天然免疫和過繼免疫有著非常重要的作用.當(dāng)LPS通過與表達在DC細胞表面的TLR4結(jié)合后,可促使DC成熟,高分泌IL-12,同時上調(diào)其MHC-Ⅱ類分子

8、表達及抗原遞呈功能.但LRDCs在受到LPS刺激后,高分泌IL-10、低分泌IL-12;其表型特征沒有明顯改變.而此特性與以前報道的調(diào)節(jié)性DC的特征相似.因此,我們設(shè)想該細胞是否也有免疫調(diào)節(jié)功能?利用CFSE標(biāo)記的OVA<,323-339>肽抗原特異性轉(zhuǎn)基因鼠的CD4<'+>T進行的體內(nèi)、體外抗原特異性增殖試驗結(jié)果表明:LRDCs明顯抑制cDCs激活的OVA<,323-339>肽抗原特異性CD4<'+>T的增殖反應(yīng).此結(jié)果說明:LRDC

9、s有負向免疫調(diào)節(jié)功能. 那么基質(zhì)細胞是通過何種機制來誘導(dǎo)前體細胞分化為LRDCs的?分化的LRDCs又是通過何種機制來實現(xiàn)對抗原特異性激活的CD4<'+>T細胞的增殖抑制?我們利用Transwell培養(yǎng)體系和純化的基質(zhì)細胞膜蛋白進行的實驗表明:基質(zhì)細胞膜蛋白與其培養(yǎng)上清都在誘導(dǎo)前體細胞分化為LRDCs中起作用;其中,主要以細胞培養(yǎng)上清為主.進一步利用抗體阻斷試驗進行的研究結(jié)果表明:阻斷基質(zhì)細胞培養(yǎng)上清中的M-CSF可以大大降低基

10、質(zhì)細胞誘導(dǎo)前體細胞分化為LRDCs的效率.說明基質(zhì)細胞分泌的M-CSF在LRDCs的分化中起一定的作用.為進一步闡明LRDCs體外抑制抗原特異性T細胞活化增殖的機制,我們針對LRDCs的特性,分別用IL-10、TGF-β、B7H-1的中和性抗體、PGE<,2>的阻斷劑消炎痛及IDO抑制劑來阻斷LRDCs的生物學(xué)效應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)PGE<,2>的阻斷劑消炎痛能大部分逆轉(zhuǎn)LRDCs對T細胞增殖的抑制效應(yīng).此結(jié)果說明:LRDCs在一定程度上是通過

11、分泌PGE<,2>來實現(xiàn)其免疫抑制功能的. IFN-Y是一類主要由活化的Th1細胞分泌的細胞因子.在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)LRDCs在抑制OVA<,323-339>肽抗原特異性CD4<'+>T細胞增殖時,其共培養(yǎng)上清中IFN-Y分泌水平上調(diào).考慮到IFN-Y在免疫耐受與免疫負向調(diào)節(jié)中的作用,我們不禁要問:高分泌的IFN-Y是否也是LRDCs負向調(diào)節(jié)功能的機制之一呢?鑒于IFN-Y參與誘導(dǎo)活化的T細胞發(fā)生凋亡,那么在LRDCs的效應(yīng)中

12、除了CD4<'+>T細胞增殖抑制外,是否還有活化CD4<'+>T細胞的凋亡發(fā)生?為此,我們首先分析了實驗各組中的CD4<'+>T細胞的凋亡率,結(jié)果發(fā)現(xiàn):LRDCs能夠誘導(dǎo)活化的CD4<'+>T細胞發(fā)生凋亡.利用中和性抗IFN-Y抗體進行的阻斷試驗進一步證實:當(dāng)IFN-Y被阻斷后,LRDCs介導(dǎo)的抗原特異性T細胞增殖抑制現(xiàn)象被部分逆轉(zhuǎn),同時,凋亡發(fā)生率也下調(diào).這一結(jié)果表明加入LRDCs共培養(yǎng)后,上清中高分泌的IFN-y是其抑制抗原特異性T

13、細胞增殖和誘發(fā)其凋亡的又一機制. 為進一步利用體內(nèi)試驗說明LRDCs的負向免疫調(diào)節(jié)功能,我們還利用冰浴勻漿+超速離心法制備的正常小鼠自身肝臟抗原(S100)和福氏完全佐劑共同免疫小鼠,制備了小鼠自身免疫性肝炎的模型,并利用此模型來研究過繼的LRDCs細胞是否對此自身免疫病的發(fā)生也有抑制效應(yīng).動物試驗的結(jié)果表明:LRDCs的過繼能夠減輕該模型的病理損害. 由于體外實驗表明:LRDCs是由骨髓造血前體細胞經(jīng)肝臟基質(zhì)細胞誘導(dǎo)分

14、化而來,那么體內(nèi)的相應(yīng)群體是否也可由造血前體分化而來?為證明此假設(shè),我們建立了經(jīng)腸系膜靜脈過繼前體細胞進入肝內(nèi),進行了肝內(nèi)前體細胞原位發(fā)育的實驗研究.實驗結(jié)果表明:將骨髓來源的造血前體細胞經(jīng)腸系膜靜脈過繼后,前體細胞主要滯留在肝內(nèi)并可完成肝內(nèi)的原位分化發(fā)育.經(jīng)流式分析過繼GFP造血前體細胞分化后的表型結(jié)果說明,骨髓來源的造血前體細胞在肝內(nèi)分化成多群細胞,其中包括與LRDCs有相似表型的細胞群.此結(jié)果在體內(nèi)證明了肝臟內(nèi)LRDCs的相應(yīng)群體

15、也可由骨髓來源的造血前體細胞分化而來.以上實驗結(jié)果表明,肝臟微環(huán)境可以促進造血前體細胞分化為具有免疫負向調(diào)節(jié)功能的樹突狀細胞,這一效應(yīng)可能參與肝臟免疫耐受的形成. 我們利用肝基質(zhì)細胞模擬肝臟微環(huán)境研究了其對NK細胞分化、趨化及活化等生物學(xué)特性的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn):骨髓來源的Lin'CD117<'+>在外源性IL-15存在條件下,與肝基質(zhì)細胞共育后,部分前體細胞可分化成NK1.1陽性細胞.該細胞能分泌IFN-y、并表達Perfrin和

16、Granzyme B.其中,部分分化的NK1.1陽性細胞還表達Ly49A,表現(xiàn)出了immature NK細胞的細胞特性.進而利用Transwell培養(yǎng)體系和阻斷性抗體的試驗結(jié)果表明,該immature NK細胞的分化同時依賴IL-15和肝基質(zhì)細胞分泌的細胞因子. 我們還利用該基質(zhì)細胞模擬肝臟微環(huán)境研究了其對外周NK細胞趨化、活化的影響.結(jié)果表明:NK細胞表達TLR3,并能被Poly I∶C所活化.肝基質(zhì)細胞可通過分泌的因子趨化N

17、K細胞,尤其是Poly I∶C活化的NK細胞向基質(zhì)細胞粘附,而且,肝臟基質(zhì)細胞還可以促進Poly I∶C活化的NK細胞的進一步活化,表現(xiàn)為IFN-γ分泌的增加及NK細胞殺傷活性的增強.這一促進效應(yīng)是通過基質(zhì)細胞表面表達的Fibronectin與NK細胞表面的配體結(jié)合來實現(xiàn)的.以上結(jié)果提示肝臟免疫微環(huán)境可以促進NK細胞的肝內(nèi)分化、外周趨化及在肝內(nèi)的活化功能進一步增強,此效應(yīng)可能參與肝臟內(nèi)對外源性病原微生物的免疫應(yīng)答的啟動. 綜上所

18、述,在本研究中,我們在體外分離培養(yǎng)了成纖維樣肝臟基質(zhì)細胞,利用該細胞來模擬肝臟的免疫微環(huán)境,觀察了其對造血前體細胞和NK細胞的不同效應(yīng).結(jié)果發(fā)現(xiàn),肝臟基質(zhì)細胞可以促進造血前體細胞分化成具有負向免疫調(diào)節(jié)功能的樹突狀細胞,同時,在IL-15存在的條件下,可以促進部分前體細胞分化為Immature NK細胞.并可以促進活化NK細胞的進一步的活化.以上結(jié)果提示,肝臟的免疫微環(huán)境可能通過對肝臟內(nèi)不同細胞的不同調(diào)控作用,來實現(xiàn)肝臟對特定抗原誘導(dǎo)免疫