大鼠骨髓間充質干細胞向膽堿能樣神經元的分化及其過程中Wnt3a表達的研究.pdf

1、第一部分大鼠骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)鑒定及其向膽堿能樣神經元的誘導分化 目的：從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞(BMSCs)并探討其生物學特性。研究體外BMSCs向膽堿能樣神經元誘導分化的情況。 方法：采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)獲得大鼠BMSCs，根據(jù)培養(yǎng)細胞的貼壁能力進行純化，相差顯微鏡下觀察其形態(tài)變化，傳至三代的細胞一部分進行CD71免疫熒光技術檢測。另一部分細胞分為三組：誘導分化組，應用音猬因子(Shh)、維甲

2、酸(RA)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對BMSCs進行誘導分化；自然分化組，加入1％血清自然分化；對照組，不加誘導因子，按前方法繼續(xù)培養(yǎng)BMSCs。誘導72h后觀察細胞形態(tài)變化并進行膽堿能神經元特異性標志物--膽堿能乙酰轉移酶(CHAT)免疫熒光技術檢測。 結果：原代培養(yǎng)的細胞形態(tài)多樣，有大的扁平狀細胞、蜘蛛狀細胞和小的圓形細胞。經傳代后，匯合細胞趨于一致，即小的成纖維樣細胞和少數(shù)大的扁平細胞。培養(yǎng)至三代的細胞幾乎都表達

3、CD71，陽性率高達99％。誘導72h后，誘導分化組的細胞由小梭形狀逐漸變?yōu)榘麧{回縮，有細長突起的細胞。ChAT免疫熒光檢測結果顯示：誘導分化組ChAT陽性率約為15.8％；與其它兩組相比有統(tǒng)計學差異。 結論：經體外全骨髓分離培養(yǎng)由貼壁能力純化的細胞呈均一性，幾乎都表達CD71，證明培養(yǎng)的細胞為BMSCs。BMSCs有向膽堿能樣神經元分化的潛能，Shh、RA和bFGF可以在體外誘導BMSCs向膽堿能樣神經元的分化。 第二

4、部分 Wnt3a在大鼠骨髓源性膽堿能樣神經元中的表達 目的：研究大鼠BMSCs誘導的膽堿能樣神經元中Wnt3a的表達情況，探討Wnt3a，在BMSCs向膽堿能樣神經元誘導分化過程中的可能作用。 方法：體外分離培養(yǎng)的第三代BMSCs進行分組實驗。實驗共分三組：膽堿能樣神經元誘導分化組，自然分化組和對照組。誘導72h后，分別提取各組細胞總RNA，應用半定量逆轉錄PCR(RT-PCR)技術分析Wnt3a在誘導前后細胞中的表達變