表達(dá)IL-21重組狂犬病病毒免疫原性研究.pdf

1、狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一種人獸共患傳染病，每年約有59000人死于狂犬病，我國(guó)是狂犬病高發(fā)國(guó)家之一?？袢∫坏┌l(fā)病其致死率幾乎為100％，疫苗接種是預(yù)防狂犬病的最有效方法。
　　狂犬病疫苗在免疫后可以通過(guò)T細(xì)胞依賴和T細(xì)胞非依賴的途徑激活B細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而激活機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，預(yù)防狂犬病的發(fā)生。前期研究表明，白介素-21(Interleukin-21，IL-21)信號(hào)通路

2、缺失后對(duì)RABV免疫后的抗體誘導(dǎo)水平產(chǎn)生影響，提示IL-21在RABV的免疫原性中起到重要作用。因此，為了進(jìn)一步探索IL-21在RABV的免疫原性中的作用機(jī)制，本研究擬通過(guò)反向遺傳操作構(gòu)建表達(dá)IL-21的重組RABV，并利用體外和體內(nèi)一系列實(shí)驗(yàn)對(duì)該重組RABV進(jìn)行研究:
　　首先，通過(guò)反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)拯救表達(dá)鼠源IL-21重組RABV，命名為L(zhǎng)BNSE-IL21，通過(guò)ELISA檢測(cè)IL-21的體外表達(dá)情況，結(jié)果表明LBNSE-I

3、L21感染BSR細(xì)胞可以表達(dá)IL-21且具有劑量依賴性;此外，LBNSE-IL21在BSR細(xì)胞和NA細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線與親本毒株LBNSE幾乎一致，表明外源基因IL-21的插入對(duì)病毒的增殖沒有影響;在病毒致病性方面，將LBNSE-IL21腦內(nèi)注射小鼠后，小鼠無(wú)明顯臨床癥狀，且體重基本保持上升趨勢(shì)，與親本毒株LBNSE體重變化曲線相似，表明IL-21的表達(dá)對(duì)致病性沒有顯著影響。
　　進(jìn)一步研究IL-21的表達(dá)對(duì)免疫原性的影響機(jī)制，LBN

4、SE-IL21和LBNSE感染Balb/c小鼠，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠體液免疫應(yīng)答中各類免疫細(xì)胞的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與LBNSE相比，LBNSE-IL21不能激活淋巴結(jié)或外周血液中的樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC），但可以顯著提高淋巴結(jié)中濾泡性輔助細(xì)胞(follicular helper Tcells，Tfh)細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞(germinal center B，GCB)數(shù)量，表明LBNSE-IL21免疫后表達(dá)的IL-2

5、1可以促進(jìn)Tfh細(xì)胞和GC B細(xì)胞的生成，影響生發(fā)中心的發(fā)育。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LBNSE-IL21可以促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞（Plasma cells，PC）的分化，在骨髓產(chǎn)生更多數(shù)量的長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞(Long-lasting Plasma cells)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的中和抗體。
　　最后，為了探究LBNSE-IL21作為疫苗的免疫效果，將LBNSE-IL21和LBNSE免疫ICR小鼠，采集免疫后第1-7周的小鼠血清，利用FAVN

6、測(cè)定中和抗體效價(jià)。檢測(cè)結(jié)果顯示LBNSE-IL21在免疫后第1周便快速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，并且第1-6周的抗體水平均顯著高于親本毒株LBNSE。這表明LBNSE-IL21免疫后可以更快誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體。此外，在免疫后第三周，利用腦內(nèi)注射50 MICLD50的CVS-24對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，最終LBNSE-IL21免疫后可提供高達(dá)92％的保護(hù)率，顯著高于親本病毒免疫保護(hù)率68％。
　　綜上所述，LBNSE-IL21免疫