霍亂弧菌LysR家族基因vc2324及其調(diào)控基因vc2323功能的研究.pdf

1、烈性傳染病霍亂由革蘭氏陰性細(xì)菌霍亂弧菌所引起，該細(xì)菌主要毒力基因CTXΦ和VPI（霍亂弧菌毒力島）受AphB-ToxR級(jí)聯(lián)調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控，該系統(tǒng)中LysR家族基因aphB直接調(diào)控霍亂弧菌毒力基因的表達(dá)。LysR家族基因廣泛存在于細(xì)菌各種屬中，為原核生物中目前已知最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，其調(diào)控的基因功能多樣，涉及合成代謝、群體感應(yīng)、毒力等眾多方面。目前發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌基因組中約有40個(gè)LysR型基因，其中大多尚未被研究。
　　 本文選取其中

2、4個(gè)未被研究的LysR型基因分別構(gòu)建其缺失突變株，通過比較突變株與野生株在定殖能力、毒力、生物膜形成能力等方面的差異，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)參與霍亂弧菌定殖的LysR型基因vc2324。檢測(cè)其相鄰上游基因vc2323的轉(zhuǎn)錄情況，證實(shí)vc2324正調(diào)控vc2323的轉(zhuǎn)錄。宿主腸道競(jìng)爭(zhēng)定殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)vc2323缺失株定殖能力顯著下降且較vc2324下降幅度更大。結(jié)合LysR家族基因經(jīng)典調(diào)控模式，推測(cè)vc2323為影響霍亂弧菌定殖的功能基因。
　　

3、 蛋白質(zhì)同源性分析發(fā)現(xiàn)，假設(shè)蛋白VC2323與大腸桿菌中碲抗性蛋白TehA、流感嗜血桿菌HiTehA和擬南芥中SLAC1通道蛋白屬于同源蛋白，推測(cè)該蛋白可能具有亞碲酸鹽抗性、多重耐藥性等多種功能。通過TcpA western blot和tcpA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)vc2323、vc2324均不影響霍亂弧菌毒力蛋白TCP的表達(dá)和形成。檢測(cè)不同物質(zhì)對(duì)vc2323表達(dá)的影響，并比較vc2323缺失株和野生株對(duì)KNO2、H2O2的敏感性差異，發(fā)

4、現(xiàn)CO2/HCO3-不影響vc2323的表達(dá)，vc2323與霍亂弧菌NO/NO2-抗性、活性氧抗性無明顯關(guān)系。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)vc2323、vc2324均不影響霍亂弧菌在LB培養(yǎng)基中生物膜的形成，也與霍亂弧菌對(duì)H+耐受力無關(guān)。
　　 體外競(jìng)爭(zhēng)黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):粗膽鹽存在時(shí)，vc2323缺失株較野生株對(duì)小鼠小腸的黏附力明顯下降，且隨黏附時(shí)間的延長差異更加顯著;而當(dāng)無粗膽鹽存在時(shí)，二者對(duì)腸道的黏附力無明顯差異。且體外實(shí)驗(yàn)表明，野生株與vc23

5、23缺失株對(duì)粗膽鹽的敏感性相同。綜合以上結(jié)果，分析vc2323對(duì)霍亂弧菌定殖能力的影響可能是因?yàn)樵诖帜扄}存在時(shí)其能夠影響霍亂弧菌對(duì)宿主腸道的黏附能力，進(jìn)而導(dǎo)致vc2323缺失株較野生株定殖能力顯著下降，詳細(xì)的分子機(jī)制尚待更深入的研究。
　　 同時(shí)，比較不同抗菌物質(zhì)對(duì)缺失株與野生株最小殺菌濃度的差異，發(fā)現(xiàn)vc2323缺失株對(duì)氯霉素和萘啶酮酸的耐受性分別下降了約64％和74％，對(duì)亞碲酸鉀的抗性下降了約33％，表明vc2323還參與霍