人原發(fā)性肝癌組織中干細胞樣肝癌細胞的分離鑒定及差異表達基因的篩選.pdf

1、腫瘤細胞與干細胞在許多方面具有相似之處：它們都具有“未分化”的細胞表型；干細胞具有遷移特性，而癌細胞有轉(zhuǎn)移的能力；干細胞與癌細胞在一定條件下可以互相轉(zhuǎn)化等。此外，已知腫瘤的發(fā)生需要經(jīng)歷多次的突變，與已分化的終末期功能細胞相比，干細胞更容易積累多次突變的轉(zhuǎn)化效應(yīng)。這些現(xiàn)象表明腫瘤可能起源于干細胞。研究發(fā)現(xiàn)急性髓細胞樣白血病細胞中能分離出與骨髓造血干細胞具有相同干細胞表面標(biāo)志的癌細胞，這些細胞能在免疫缺陷小鼠中誘導(dǎo)急性髓細胞樣白血病的發(fā)生;

2、這表明腫瘤組織中可能存在既具有自我增殖和自我更新特征，又具有腫瘤形成能力的腫瘤干細胞。目前已在多種惡性實體瘤中發(fā)現(xiàn)有腫瘤干細胞的存在，例如乳腺癌、腦腫瘤等。原發(fā)性肝細胞癌是我國常見惡性腫瘤之一，對肝癌發(fā)病機理的研究表明，肝臟中具有肝祖細胞特征的卵圓細胞參與了肝癌的發(fā)生;肝癌組織的異質(zhì)性表明，并不是每個肝癌細胞都具有行成腫瘤的能力，肝癌細胞之間在耐藥性上也有巨大的差異，這提示肝癌組織中可能存在有具有表型和功能特殊的肝癌細胞，分離和鑒定這群

3、細胞是否具有干細胞特征對闡明肝癌發(fā)病機理、揭示肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機制具有重要的意義，并為治療肝癌提供一個新的策略。 Hoechst/FACS是新近發(fā)現(xiàn)的一種能高效富集干細胞的方法，該方法的基本原理是利用了干細胞對染料具有排斥性這一特異性功能標(biāo)志，目前已知所有的干細胞能通過細胞表面的ABC載體將進入胞內(nèi)的熒光染料Hoechst33342主動外泵至胞外，這些染色后的干細胞在紫外光激發(fā)下，表現(xiàn)為低熒光的特征，在流式細胞儀上對Hoechs

4、t熒光進行雙波長分析發(fā)現(xiàn)，這些低熒光的干細胞表現(xiàn)為邊緣性聚集，將這些邊緣細胞群分選即可達到富集和分離干細胞的目的，該方法首先在分離骨髓造血干細胞上獲得了成功，隨后的研究表明，利用該方法可以從多種組織中高效、快速地分離得到成體干細胞。 目的：利用Hoechst/FACS分離和鑒定人原發(fā)性肝癌組織中具有干細胞特征的肝癌細胞，并利用抑制性消減雜交技術(shù)分析和篩選這些干細胞樣肝癌細胞的差異表達基因。 方法： 1.機械分離結(jié)

5、合膠原酶消化法從人原發(fā)性肝癌組織中分離和制備肝癌細胞懸液； 2.肝癌細胞爬片后，用一定濃度的Hoechst33342在37℃對肝癌細胞染色90分鐘，固定細胞后，以小鼠抗人的BCRP單克隆抗體作為一抗，TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗對肝癌細胞進行免疫組化染色，封片后，在免疫熒光顯微鏡下觀察結(jié)果; 3.肝癌細胞懸液等分為兩組，一組單純用Hoechst33342進行染色，另一組同時加入鈣通道拮抗劑和相同濃度的Hoech

6、st染料，兩組細胞均染色90分鐘，然后以流式細胞儀檢測肝癌細胞中的Hoechst熒光，通過使用雙色性反射濾鏡和不同的組合濾片將每個肝癌細胞中熒光信號分為兩個部分-Hoechst蘭光部分和Hoechst紅光部分，采集這些光信號，并利用流式細胞軟件形成二維散點圖，分析兩組肝癌細胞在二維散點圖上的形態(tài)，通過設(shè)定“門”找出肝癌組織中的邊緣群細胞，并對比兩組肝癌細胞在邊緣群上的不同； 4.用PE標(biāo)記的小鼠抗人CD34、cy5標(biāo)記的小鼠抗人

7、c-kit以及FITC標(biāo)記的小鼠抗人sca-1單克隆抗體對肝癌細胞進行染色，并用流式細胞儀檢測邊緣群肝癌細胞中三種干細胞表面標(biāo)志的表達情況; 5.將分選得到的SP表型肝癌細胞和非SP表型肝癌細胞分別在加有HGF的無血清培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)，觀察細胞生長、增殖的狀況；同時將這兩種表型的肝癌細胞在軟瓊脂中培養(yǎng)，觀察克隆形成并計算克隆形成率；將這兩種在體外培養(yǎng)2周后的不同表型的肝癌細胞重新用Hoechst33342染色，并用流式細胞儀

8、檢測是否邊緣群仍然存在，以此來鑒定這兩種肝癌細胞是否具有自我更新能力； 6.分別將2×104的SP表型肝癌細胞和非SP表型的肝癌細胞在裸鼠皮下接種，對比觀察兩組肝癌細胞在裸鼠皮下形成移植瘤的能力； 7.將分選得到的SP表型肝癌細胞和正常肝組織分別提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，將SP表型肝癌細胞的cDNA作為檢測方，正常肝組織cDNA作為驅(qū)動方，經(jīng)RsaⅠ酶切后，將檢測方分為兩組分別與不同的接頭分子進行連接，將連接好

9、接頭的檢測方cDNA與過量的驅(qū)動方cDNA進行連續(xù)兩次消減雜交，雜交產(chǎn)物經(jīng)抑制性PCR和巢式PCR富集到差異表達的基因片斷，PCR產(chǎn)物通過T/A克隆連接到載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆，用PCR方法鑒定陽性克隆并測序，將測序結(jié)果登錄GeneBank進行同源性對比分析； 結(jié)果： 1.免疫組化結(jié)果證實了肝癌細胞表面有BCRP的表達，但并非所有肝癌細胞都表達BCRP，部分BCRP陽性的肝癌細胞在細胞形態(tài)上具有增殖和分裂的特征

10、；熒光顯微鏡觀察Hoechst染色后的肝癌細胞顯示Hoechst染料均勻地分布在肝癌細胞的胞漿及核仁，此外使用不同波長的濾光片均能觀察到Hoechst的熒光，表明Hoechst33342的散射光譜具有較寬的波長范圍； 2.流式細胞儀的雙波長熒光分析結(jié)果顯示在Hoechst熒光的二維散點圖上，有邊緣細胞群存在，該群細胞占整個肝癌細胞總數(shù)的5％左右，加入鈣通道拮抗劑后該群細胞明顯減少，位于邊緣部分的大部分肝癌細胞因低熒光的特征消失而

11、進入到了主細胞群中，這表明肝癌細胞的這種SP表型與ABC載體的主動外泵作用有關(guān)； 3.流式細胞檢測檢測到SP表型的肝癌細胞表面c-kit、Sca-1和CD34等干細胞標(biāo)志的最高表達率分別為67.3％、44.2％和7％，依據(jù)c-kit表達率，可以減少對邊緣群“門”設(shè)置中的非特異性； 4.分選得到的SP表型肝癌細胞在體外無血清培養(yǎng)基中生長良好，在軟瓊脂中有較高的克隆形成率，而非SP表型肝癌細胞在同樣的生長條件下則生長遲緩，軟

12、瓊脂培養(yǎng)中未見有明顯的細胞克隆形成，說明SP表型的肝癌細胞具有非常高的增殖潛能；用Hoechst33342對在體外培養(yǎng)2周后的SP表型肝癌細胞和非SP表型肝癌細胞再次進行染色，并經(jīng)流式細胞分析，結(jié)果表明SP表型肝癌細胞在體外培養(yǎng)過程中可以通過增殖再次產(chǎn)生SP表型和非SP表型肝癌細胞，而非SP表型肝癌細胞在體外培養(yǎng)后不再包含有邊緣群細胞，這說明SP表型肝癌細胞具有自我更新的特征； 5.裸鼠荷瘤實驗結(jié)果表明與非SP肝癌細胞相比，SP

13、表型肝癌細胞具有很高的致瘤能力； 6.提取的總RNA純度高，無降解；電泳結(jié)果表明反轉(zhuǎn)錄后雙鏈cDNA的RsaⅠ酶切徹底；接頭連接效率檢測結(jié)果顯示＞40％的檢測方cDNA與接頭連接成功，消減雜交后的兩輪PCR結(jié)果表明成功富集到差異表達的基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)T/A克隆后，挑取到3個陽性克隆，經(jīng)測序并經(jīng)同源性比對，確認這三個基因片段分別為表皮膜蛋白2、熱休克蛋白70和Tg737基因。 結(jié)論：利用Hoechst/FACS可以從