β-淀粉樣蛋白對癲癇發(fā)作影響的研究.pdf

1、β-淀粉樣蛋白對癲癇發(fā)作影響的研究。β-淀粉樣蛋白(p-amyloid protein，Aβ)是Alzheimer Disease(AD)腦內特征性病理改變一老年斑(senile plaques，SP)的主要成分[1]。Aβ具有對神經系統廣泛的生物學效應。高濃度的，或聚集狀態(tài)Aβ被認為具有神經毒性作用。癲癇是一種常見的腦部疾病，其特征為腦神經元過度放電所致的反復癇樣發(fā)作。一些臨床資料顯示顳葉癲癇(temporal lobe epilep

2、sy，TLE)病人的腦內可以檢測到明顯的SP，提示TLE對SP的形成有重要影響。SP的形成和癲癇發(fā)作之間的關系目前還不明了，作為SP的主要成分-Aβ可能參與加重或減輕癲癇的發(fā)作。本實驗對Aβ對癲癇發(fā)作的可能影響進行了初步研究。主要研究結果如下： 1.動物癲癇模型采用Wistar大鼠海人藻酸(Kalnic Acid，KA)(1μg/μ1，1μ1)側腦室注射。用免疫組織化學染色，免疫熒光化學方法觀察癲癇病人癲癇灶組織內Aβ以及癲癇動

3、物腦內β淀粉樣蛋白前體(Amyloid precursor protein，APP)、Aβ的分布情況。結果顯示：癲癇病人癲癇硬化灶內有Aβ的點狀分布。Wistar大鼠KA致癇6小時后，免疫組織化學染色海馬、皮層Aβx-40免疫陽性物質明顯較正常組增多；免疫熒光檢測Aβx-42，同樣見致癇大鼠腦內海馬陽性物質增加。另外，分別用APP-N抗體和APP-C抗體檢測顯示KA致癇大鼠腦內APP有增加，以海馬和皮層增加明顯。 2.從mRNA

4、水平觀察KA致癇大鼠腦內APP基因表達情況，以及其它神經元退行性相關蛋白-tau蛋白的基因表達，并探索可能參與APP、tau基因剪接有關機制。用RT-PCR方法檢測的結果顯示：KA致癇6h后，海馬內APPmRNA表達增加，易產生Aβ的APP異型體APP751和APP770的比例增加。對tau mRNA的5'和3'端檢測顯示tau表達在致癇6h后也明顯增加，并且有5’端發(fā)生剪輯的改變。另外剪接因子tra2β，NSSRl在KA致癇的誘導下也

5、有明顯增加。以上結果提示：癲癇發(fā)作可以促進腦內APP表達，同時癲癇可影響中樞mRNA剪輯機制，導致易產生Aβ的APP異型體增加，促進Ap產生增加。 3.為了觀察Aβ對癲癇發(fā)作的影響，用側腦室注射不同劑量的可溶性單體Aβ1-40(0.004nmo1，0.04nmo1，0.4nmo1)干預KA誘發(fā)的癲癇。通過對大鼠癲癇發(fā)作行為學觀察，發(fā)現預先給予可溶的單體Aβ1-40，大鼠癲癇發(fā)作潛伏期延長，發(fā)作強度也有一定程度減弱，以0.04nm

6、o1劑量較為明顯。 4.觀察了大鼠側腦室注射不同劑量可溶的單體Aβ1-40對KA致癇大鼠大腦皮層腦電的影響。大鼠腦內注射KA后30～40min即在皮層記錄到癇樣放電，表現為典型的單個棘波、尖波和棘慢波，以及短暫的，爆發(fā)性的多棘慢波或不規(guī)則棘慢波。而給與Aβ1-40后，這種棘慢波明顯減少，平均腦電總功率也降低，抑制效果以0.04nmo1的Aβ1-40較為明顯。通過腦電記錄進一步說明可溶性Aβ1-40單體對KA誘導癲癇發(fā)作有一定的抑制作用。

7、 5.在體外，新生6天SD大鼠海馬腦片上用picrotoxin(20μM)誘導癇樣放電。細胞外場點位記錄顯示，灌流10min左右即可記錄到持續(xù)的癇樣放電，置換灌流液，用含2nmo1 Aβ1-40的picrotoxin人工腦脊液灌流，2min后癇樣放電明顯被抑制，再用含picrotoxin人工腦脊液沖洗，再次出現癇樣放電。說明在體外Aβ也能抑制海馬腦片癇樣放電。 6.觀察Aβ1-40對KA致癇引起神經元損傷的影響，外源性地

8、給與不同劑量的可溶的單體Aβ1-40(0.004nmo1，0.04nmo1，0.4nmo1)側腦室注射，再同側側腦室注射KA(1ug)。焦油紫(cresyl violet，CV)染色和Fluoro-JadeB染色均提示Aβ1-40可減少海馬神經元損傷。結果提示，外源性給予的一定劑量的可溶性單體Aβ1-40可抑制KA誘導的興奮性毒性對神經元的損害。 7.為進一步觀察內源性的Aβ對癲癇發(fā)作是否有影響，我們給予大鼠側腦室注射γ分泌酶抑

9、制劑(13.5μM，2μ1)，抑制APP水解產生Aβ，再同側側腦室注射致癇劑量的KA。行為學觀察結果和單純KA致癇組沒有顯著差別，但CV染色和Fluoro-Jade B染色顯示海馬神經元損害較單純KA組嚴重，從而進一步提示內源性的Aβ也有一定抑制KA誘導的癲癇發(fā)作及其導致的神經元損害的作用。 8.由于各種致癇刺激可促進c-fos迅速表達，根據FOS蛋白在致癇刺激后的表達程度的高低可判斷藥物或其它相關因素在治療或致癇作用中的大小。

10、我們采用免疫組化的方法觀察了給予不同處理后的大鼠腦內FOS蛋白的分布情況。結果顯示，在單純KA致癇組腦內海馬、梨狀皮層、杏仁核這些與癲癇發(fā)作密切相關的部位的FOS蛋白均較正常對照組顯著增加。KA誘導致癇前預先側腦室注射γ分泌酶抑制劑抑制(13.5μM，2μ1)Aβ的產生，導致動物的梨狀皮層、杏仁核部位較單純KA組明顯增加；預先給予0.04nmo1的可溶性Aβ可抑制各腦區(qū)KA誘導的FOS蛋白表達的增加。提示適當劑量的可溶的Aβ可抑制KA的

11、興奮毒性作用。 9.為觀察纖維狀或高劑量的Aβ對KA誘導癲癇的腦損害，預先給Wistar大鼠側腦室內注射高劑量的Aβ(0.4μmo1)或海馬內注射纖維狀Aβ(0.4μmo1)，再同側側腦室注射KA(0.4μ1，1μg/μ1)。CV染色和Fluoro-JadeB染色顯示纖維狀Aβ和高劑量的Aβ均加重了KA誘導的海馬神經元的損害。這可能提示為什么AD病人是老年癲癇的高危人群[3]。 10.初步探討可溶性單體Aβ對癲癇抑制作用

12、的可能機制。用免疫組織化學方法觀察到癲癇發(fā)作6h時，Munc-18蛋白水平表達下降，而預先給予Aβ再誘發(fā)癲癇組Munc-18蛋白表達較正常組變化不明顯，由于Munc-18對遞質釋放有負性調節(jié)作用，說明AD可能通過影響Munc-18的表達調節(jié)神經遞質的釋放。 綜上所述，癲癇病人以及海人藻酸(KA)誘導致癇大鼠腦內有Aβ的增加，Aβ的增加與KA致癇導致的APP表達上調有關。一定劑量的可溶性單體Aβ1-40可抑制動物KA誘導的癲癇的發(fā)