活性氧對腎細胞癌多藥耐藥基因表達的雙相調(diào)節(jié)作用.pdf

1、前言：腎細胞癌是成人腎臟病變中最常見的一種惡性腫瘤，約占全身腫瘤的2％-3％。因為先天性多藥耐藥，腎細胞癌對葸環(huán)類、長春花堿類、及其它抗腫瘤藥物均不敏感。腎細胞癌的多藥耐藥性是由多藥耐藥基因(mdr1)編碼的多藥耐藥蛋白(P-glycoprotein，P-gp)過度表達所致。目前發(fā)現(xiàn)的P-gp抑制劑由于較大的毒付作用而難以應用于臨床。因此，應當尋找更為有效而低毒的逆轉(zhuǎn)方法來克服腫瘤的多藥耐藥?；钚匝?ROS)是生物體有氧代謝產(chǎn)生的一類活

2、性含氧化合物的總稱，主要包括超氧陰離子(O<,2>·<'->)，羥自由基(·OH)，以及過氧化氫(H<,2>O<,2>)和單線態(tài)氧(<'1>O<,2>)等，這些物質(zhì)具有較強的氧化能力。過去ROS被認為只是一類損傷細胞的毒性物質(zhì)，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)ROS在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中起著重要的的作用。而新近的研究表明，P-gp的表達受到細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的。影響，能夠被ROS所調(diào)節(jié)。因為一些結構和功能迥異的mdr1誘導因子如：表皮生長因子(E

3、GF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、阿霉素(doxorubicin)、苯并芘(benzo[a]pyrene)或紫外線作用于細胞時都要產(chǎn)生ROS(包括：超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫)，由此推測ROS可能是它們調(diào)節(jié)mdr1基因和P-gp蛋白的共同通路。Warterlberg等已經(jīng)證實在培養(yǎng)的人前列腺腫瘤多細胞團中內(nèi)源性H<,2>O<,2>能夠調(diào)節(jié)P-gp蛋白的表達。另有作者發(fā)現(xiàn)高水平ROS造成的氧化應激能夠上調(diào)多藥耐藥相關蛋白(MRP)

4、的表達。 目的：選擇P-gp過表達的腎癌細胞系ACHN及786-0作為MDR實驗模型，檢測外源性活性氧H<,2>O<,2>對細胞增殖的影響，探討H<,2>O<,2>是否能夠調(diào)節(jié)腎癌細胞mdr1基因的表達，以進一步研究多藥耐藥的活性氧機制，尋求新的逆轉(zhuǎn)策略。 方法： 1，ACHN及786-0細胞用不同濃度的外源性H<,2>O<,2>孵育后WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測法檢測H<,2>O<,2>對細胞增殖的影響，同

5、法檢測計算阿霉素、長春新堿對兩種細胞的IC50值，觀察H<,2>O<,2>對化療藥物細胞毒性的影響。 2，以實時熒光定量RT PCR法定量檢測H<,2>O<,2>對mdr1 mRNA基因表達的作用，目的基因上游引物序列：5’CCTGTACGCCAACACAGTGC 3’，下游引物序列：5’ATACTCCTGCTTGCTGATCC 3’。 3，蛋白質(zhì)印跡分析檢測H<,2>O<,2>對P-gp表達的影響。 4．羅丹明

6、123的蓄積和外排實驗測定P-gp功能。 結果： 1，低濃度H<,2>O<,2>(0.00001mM-0.1mM)，具有促細胞增殖作用，而高濃度H<,2>O<,2>(0.1mM以上)呈現(xiàn)濃度依賴的細胞毒性。兩種作用都呈時間依賴性，在作用72小時后，0.01、0.02、0.04mM濃度下的最大促細胞生長作用最為明顯，0.1、0.2、0.4mM濃度下的抑制作用在72小時最顯著。H<,2>O<,2>聯(lián)合阿霉素、長春新堿孵育72

7、小時后，0.005、0.01、0.02 mM H<,2>O<,2>分別增加了化療藥物的細胞毒性，其中0.02mMH<,2>O<,2>使ACHN細胞對阿霉素，長春新堿的敏感性分別增加3.49倍，2.95倍(P<0.01)；786-0增加5.43倍，4.47倍((P<0.01)。而高濃度的H<,2>O<,2>(0.2mM)使阿霉素，長春新堿對ACHN細胞的IC50值分別增加3.0及2.04倍，786-0細胞分別增加2.85，3.57倍((P

8、<0.01)。0.1mM、0.2mM H<,2>O<,2>顯著升高了ACHN，786-0的mdr1 mRNA表達水平，分別上調(diào)至對照組的1.29，3.4倍；1.35，2.82倍。相反，低濃度的(0.01 mM、0.02mM)H<,2>O<,2>降低了mdr1 mRNA表達水平，分別下1.18，4.05倍；1.22，3.76倍((P<0.01)。Western blot結果顯示P-gp的表達與mdr1mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出一致性的變化。羅

9、丹明123實驗顯示，0.02mMH<,2>O<,2>孵育AChN及786-0細胞72小時后不同程度使細胞內(nèi)Rh123蓄積增加，而0.2mMH<,2>O<,2>濃度下降低了Rh123的蓄積((P<0.01)。結論：1，外源性活性氧H<,2>O<,2>對腎癌ACHN及786-0細胞增殖具有雙重作用；低濃度H<,2>O<,2>能夠促進細胞生長，高濃度抑制細胞生長。 2，我們首次意外發(fā)現(xiàn)，H<,2>O<,2>對腎癌ACHN及786-0細