硫酸軟骨素酶ABC對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 脊髓損傷(SCI)后有非常高的致殘率。包括運(yùn)動(dòng)、感覺的喪失和慢性疼痛、肌肉僵直等體征。雖然有部分患者損傷后可出現(xiàn)自發(fā)恢復(fù)，但恢復(fù)非常有限，絕大部分患者會(huì)留下嚴(yán)重后遺癥。目前無有效方法來治療，臨床上各種治療措施結(jié)果均不樂觀。令人欣慰的是隨著研究深入，對(duì)脊髓損傷的損傷和恢復(fù)機(jī)制有了一定的了解，在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?，一部分治療已取得了令人鼓舞的結(jié)果。哺乳動(dòng)物SCI后神經(jīng)元軸突僅有微弱的再生潛能，與神經(jīng)元本身的特點(diǎn)和胞外微環(huán)境中抑制因素

2、有關(guān)。各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的應(yīng)用雖能促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生修復(fù)，但SCI后微環(huán)境中大量存在的抑制因子的阻礙作用成為SCI修復(fù)未形成有效功能恢復(fù)的重要原因之一。研究認(rèn)為SCI后由膠質(zhì)瘢痕分泌的硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)是軸突再生修復(fù)中的重要抑制因子。SCI后阻斷CSPGs作用，軸突表現(xiàn)出了較強(qiáng)的再生潛能并能促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，但對(duì)SCI后星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的作用研究較少，特別是對(duì)在體的研究。 目的： 本課題通過改良Alle

3、n方法建立大鼠脊髓損傷模型，于網(wǎng)膜下腔置管并經(jīng)導(dǎo)管注射ChABC抑制CSPGs。通過檢測(cè)脊髓損傷后各組不同時(shí)相點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)、后肢運(yùn)動(dòng)功能(BBB評(píng)分)的改變，評(píng)價(jià)ChABC對(duì)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)作用。檢測(cè)受損脊髓細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，初步觀察ChABC對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。免疫組化染色觀察ChABC對(duì)脊髓損傷后GFAP、NF200改變的影響，觀察對(duì)SCI后星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的影響，并初步探討CSPGs

4、抑制脊髓損傷后功能恢復(fù)的部分機(jī)制。 方法： 1．SD大鼠72只，體重250～300g，隨機(jī)分為假手術(shù)組(無損傷，不給藥)、對(duì)照組(損傷，給生理鹽水)、治療組(損傷，給ChABC)，分為4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即：術(shù)后1d、1w、2w、4w，均蛛網(wǎng)膜下給藥，n=24。以改良Allen法制作T<,10>脊髓損傷模型，致傷能量為35gcf，造成輕中度的脊髓損傷。 2．用改良的Yaksh法行蛛網(wǎng)膜下腔置管。假手術(shù)組只打開椎板，并置管

5、，不給藥；對(duì)照組和治療組分別在傷后即刻經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)管注入等容積(6μl)生理鹽水、ChABC(1u/ml)，在傷后第二天開始每天給同量藥一次，1w后拔出導(dǎo)管。 3．分別在傷前、傷后1d、1w、2w、4w進(jìn)行運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)和BBB功能評(píng)分。 4．分別在傷后1d、1w、2w、4w處死各組大鼠，進(jìn)行HE、尼氏(Nissl)染色及免疫組化GFAP、NF200和Bcl-2、Bax染色，觀察傷后脊髓組織形態(tài)和星形膠質(zhì)細(xì)胞、

6、膠質(zhì)瘢痕增生以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。免疫組化結(jié)果用生物醫(yī)學(xué)圖像分析儀行平均光密度(AOD)分析，分析結(jié)果進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)比較。 結(jié)果： 1．應(yīng)用改良Allen法成功構(gòu)建大鼠脊髓挫傷模型，致傷力為35gcf，模型構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一；順利進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔置管，并順利給藥1w。 2．所有動(dòng)物。BBB評(píng)分在術(shù)前均為21分，假手術(shù)組傷后分值改變非常小，治療組和對(duì)照組在損傷后1d雙下肢全癱(BBB評(píng)分為O)，在傷后第2天開始逐

7、漸有自發(fā)恢復(fù)，但各組之間恢復(fù)的程度不同。治療組恢復(fù)快于對(duì)照組。假手術(shù)組大鼠MEP的N1潛伏期改變較小，治療組和對(duì)照組的潛伏期在術(shù)后1d時(shí)有明顯的延長(zhǎng)，以后均有恢復(fù)，但治療組恢復(fù)優(yōu)于對(duì)照組。 3．NF200在假手術(shù)組著色淺，著色神經(jīng)元較少。治療組和對(duì)照組傷后著色神經(jīng)元數(shù)開始增多，但治療組明顯多于對(duì)照組。假手術(shù)組GFAP染色面積在1d、1w、2w和4w時(shí)無明顯變化。治療組和對(duì)照組GFAP面積傷后1d即開始增大，治療組要明顯小于對(duì)照組

8、。 4．術(shù)后假手術(shù)組Bax和Bcl-2蛋白均表達(dá)少，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)間改變不明顯。對(duì)照組和治療組中Bax蛋白傷后1d達(dá)高峰，1w后逐漸減弱；Bcl-2在對(duì)照組傷后1d時(shí)達(dá)高峰，治療組在1w時(shí)達(dá)高峰。對(duì)照組比治療組Bax蛋白表達(dá)明顯增多，而Bcl-2表達(dá)則明顯減少，差異顯著，并且持續(xù)時(shí)間短。 結(jié)論： 1．ChABC能促進(jìn)鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù) 2．ChABC能增強(qiáng)大鼠脊髓損傷后組織神經(jīng)細(xì)胞的抗凋亡能力