硫酸軟骨素酶ABC對大鼠腦損傷(TBI)模型膠質瘢痕影響的實驗研究.pdf

1、腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是公認的多發(fā)病及難愈的傷病之一,具有高致殘率、高耗費、高死亡率等特點。目前在應用各種治療方法的幸存者中,有大約75％的病員呈不同程度勞動能力喪失,其中重度致殘者約占40％,對家庭、社會均造成沉重負擔。如何有效地修復腦損傷,迄今為止尚無滿意有效的對策,究其原因主要在于已成熟的中樞神經再生困難。然而,隨著醫(yī)學科學的進步,近年來對中樞神經系統(tǒng)(central nervous sys

2、tem,CNS)神經再生的一系列實驗研究成果為腦損傷后神經再生帶來了新的希望。目前人們對于腦組織損傷后神經再生的認識包括以下幾個方面:1、神經細胞本身不能再生,神經干細胞(neural stem cells,NSCs)、胚胎組織或其它移植的細胞能否向腦神經細胞轉化進而修復腦損傷尚研究階段。2、膠質細胞可以再生,并且在損傷后會大量增生,試圖“修復”損傷,但大量的膠質細胞增生形成膠質瘢痕,反成為軸突再生的障礙。3、軸突在腦損傷后的再生能力,

3、雖然受到諸多因素(包括抑制因子存在等)影響,但還是具備再生的能力。許多新的方法如神經移植包括周圍神經移植、NSCs移植、嗅鞘細胞移植、基因治療等均可使成年動物受損傷的腦組織表現(xiàn)出某種程度的功能恢復。
　　 腦損傷后會啟動一系列與形成瘢痕組織相關的細胞及分子間的反應,形成以星形膠質細胞為主的瘢痕組織,這種致密的膠質瘢痕包囊腦的損傷區(qū)從而把腦損傷區(qū)與正常腦組織隔開,使再生的神經軸突不能越過損傷區(qū)的膠質瘢痕,造成再生的神經軸突不能與突

4、觸后神經元建立功能性鏈接；同時星形膠質細胞分泌的蛋白多糖即硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)在損傷區(qū)的堆積也是抑制神經再生的重要原因。所以,膠質瘢痕組織是導致腦組織神經難以再生的主要原因之一。
　　 研究證實,CSPGs有非常強的抑制軸突再生功能,而作為細菌胞外裂解酶的硫酸軟骨素酶ABC(chondroitin sulfate enzyme ABC,chABC)則

5、可以通過干預CSPGs對神經修復的抑制作用而減少神經膠質瘢痕,促進神經再生。
　　 本課題研究主要內容是:使用自由落體撞擊法建立腦損傷膠質瘢痕的動物模型,并依照分組條件在治療組的動物損傷點上即時注射不同濃度的chABC；在此后的1周、2周及4周三個時間點取出各組腦組織標本,行鏡下比較觀察各組(包括正常組、模型組對照組、治療組)的損傷點星形膠質細胞聚集程度以了解瘢痕組織生長情況,并以免疫組化和蛋白印跡觀察CSPGs及膠質纖維酸性蛋

6、白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達情況,以判斷去瘢痕的治療效果。
　　 第一部分、大鼠腦損傷后膠質瘢痕模型的制作
　　 目的:構建大鼠腦損傷膠質瘢痕模型,為后續(xù)進一步對去瘢痕組織治療研究奠定基礎。
　　 方法:wistar大鼠隨機分為4組,每組9只,分別為模型對照組、治療組1(1U/mlChABC)、治療組2(2.5U/ml ChABC)、治療組3(5U/ml C

7、hABC)；另還有2只為正常對照組。采用改進的Feeney法按自由落體原理制造成大鼠重度TBI模型。撞擊錘重20 g,下落高度30 cm,落體致傷的沖擊力為20 x30 g·cm。將大鼠頭部固定于立體頭架上,沿頭皮中線矢狀位切開皮膚約2 cm,然后逐層切開皮下筋膜,分離骨膜至顱骨,以前囪尾側2 mm、矢狀縫左側2 mm的左側大腦皮質后肢運動區(qū)域為中心,開一直徑為5mm的圓形骨窗,硬膜保持完整。20 g撞擊捶從30cm高的外周套管下落,撞

8、擊已置于骨窗硬膜上的撞桿；撞擊傷后,充分止血即縫合頭皮。治療組則即時在損傷點注射不同濃度的chABC。
　　 結果:以Feeney自由落體撞擊法建立了重度大鼠TBI模型,為大鼠TBI形成膠質瘢痕提供了研究客體。
　　 結論:用自由落體撞擊法建立腦損傷膠質瘢痕形成模型,腦損傷確切,具備膠質瘢痕形成的條件。
　　 第二部分、大鼠腦損傷后膠質瘢痕的形態(tài)學確認
　　 目的:觀察星形膠質細胞聚集,并初步確定異常組織

9、膠質瘢痕的形成及其范圍。
　　 方法:自由落體撞擊法后,將腦損傷的大鼠飼養(yǎng)1周以上,以予損傷腦組織的瘢痕組織充分生長。分別在大鼠TBI后的第1周、2周及4周三個時間點灌注固定并取出大鼠腦組織,病理學檢測,確定異常的膠質瘢痕組織。
　　 結果:在三個時間點,各組均能清晰呈示出損傷點處的星形膠質細胞異常聚集,與正常腦組織之間邊界清晰,且在TBI后第2周及4周的模型對照組鼠標本中,星形膠質細胞的異常聚集程度較1周更加明顯,但2

10、周和4周時間點之間的膠質細胞聚集程度沒有明顯差異變化。相對于模型對照組而言,三個治療組的星形膠質細胞異常聚集明顯減少。
　　 結論:本實驗條件下,大鼠TBI后的第1周,即出現(xiàn)膠質瘢痕；受損傷的腦組織與正常腦組織之間在星形膠質細胞聚集程度上差別明顯。
　　 第三部分、硫酸軟骨素酶ABC對腦損傷模型膠質瘢痕的影響
　　 目的:比較觀察ChABC對腦損傷膠質瘢痕的影響。
　　 方法:各組標本根據(jù)免疫組化和蛋白印

11、跡的不同要求,分別行4％多聚甲醛灌注和冰凍保存。其中多聚甲醛灌注后的標本經石蠟包埋、切片、脫蠟、及常規(guī)免疫組化檢測CSPGs、GFAP分布情況；而用于檢測蛋白印跡的冰凍標本,則經過蛋白提取和變性、膠的制作、點樣、電泳、轉膜、封閉、ECL檢測,暗室曝光等操作后,觀察CSPGs、GFAP表達情況。
　　 結果:模型對照組CSPGs免疫組化染色后的腦損傷組織切片上,可清晰觀察到膠質瘢痕組織呈淡黃色,膠質組織較正常腦組織染色深,邊界清晰