硫酸軟骨素酶ABC對大鼠腦損傷(TBI)模型膠質(zhì)瘢痕影響的實驗研究.pdf

1、腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是公認(rèn)的多發(fā)病及難愈的傷病之一,具有高致殘率、高耗費(fèi)、高死亡率等特點(diǎn)。目前在應(yīng)用各種治療方法的幸存者中,有大約75％的病員呈不同程度勞動能力喪失,其中重度致殘者約占40％,對家庭、社會均造成沉重負(fù)擔(dān)。如何有效地修復(fù)腦損傷,迄今為止尚無滿意有效的對策,究其原因主要在于已成熟的中樞神經(jīng)再生困難。然而,隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的進(jìn)步,近年來對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous sys

2、tem,CNS)神經(jīng)再生的一系列實驗研究成果為腦損傷后神經(jīng)再生帶來了新的希望。目前人們對于腦組織損傷后神經(jīng)再生的認(rèn)識包括以下幾個方面:1、神經(jīng)細(xì)胞本身不能再生,神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)、胚胎組織或其它移植的細(xì)胞能否向腦神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)而修復(fù)腦損傷尚研究階段。2、膠質(zhì)細(xì)胞可以再生,并且在損傷后會大量增生,試圖“修復(fù)”損傷,但大量的膠質(zhì)細(xì)胞增生形成膠質(zhì)瘢痕,反成為軸突再生的障礙。3、軸突在腦損傷后的再生能力,

3、雖然受到諸多因素(包括抑制因子存在等)影響,但還是具備再生的能力。許多新的方法如神經(jīng)移植包括周圍神經(jīng)移植、NSCs移植、嗅鞘細(xì)胞移植、基因治療等均可使成年動物受損傷的腦組織表現(xiàn)出某種程度的功能恢復(fù)。
　　 腦損傷后會啟動一系列與形成瘢痕組織相關(guān)的細(xì)胞及分子間的反應(yīng),形成以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主的瘢痕組織,這種致密的膠質(zhì)瘢痕包囊腦的損傷區(qū)從而把腦損傷區(qū)與正常腦組織隔開,使再生的神經(jīng)軸突不能越過損傷區(qū)的膠質(zhì)瘢痕,造成再生的神經(jīng)軸突不能與突

4、觸后神經(jīng)元建立功能性鏈接；同時星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的蛋白多糖即硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)在損傷區(qū)的堆積也是抑制神經(jīng)再生的重要原因。所以,膠質(zhì)瘢痕組織是導(dǎo)致腦組織神經(jīng)難以再生的主要原因之一。
　　 研究證實,CSPGs有非常強(qiáng)的抑制軸突再生功能,而作為細(xì)菌胞外裂解酶的硫酸軟骨素酶ABC(chondroitin sulfate enzyme ABC,chABC)則

5、可以通過干預(yù)CSPGs對神經(jīng)修復(fù)的抑制作用而減少神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕,促進(jìn)神經(jīng)再生。
　　 本課題研究主要內(nèi)容是:使用自由落體撞擊法建立腦損傷膠質(zhì)瘢痕的動物模型,并依照分組條件在治療組的動物損傷點(diǎn)上即時注射不同濃度的chABC；在此后的1周、2周及4周三個時間點(diǎn)取出各組腦組織標(biāo)本,行鏡下比較觀察各組(包括正常組、模型組對照組、治療組)的損傷點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集程度以了解瘢痕組織生長情況,并以免疫組化和蛋白印跡觀察CSPGs及膠質(zhì)纖維酸性蛋

6、白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達(dá)情況,以判斷去瘢痕的治療效果。
　　 第一部分、大鼠腦損傷后膠質(zhì)瘢痕模型的制作
　　 目的:構(gòu)建大鼠腦損傷膠質(zhì)瘢痕模型,為后續(xù)進(jìn)一步對去瘢痕組織治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:wistar大鼠隨機(jī)分為4組,每組9只,分別為模型對照組、治療組1(1U/mlChABC)、治療組2(2.5U/ml ChABC)、治療組3(5U/ml C

7、hABC)；另還有2只為正常對照組。采用改進(jìn)的Feeney法按自由落體原理制造成大鼠重度TBI模型。撞擊錘重20 g,下落高度30 cm,落體致傷的沖擊力為20 x30 g·cm。將大鼠頭部固定于立體頭架上,沿頭皮中線矢狀位切開皮膚約2 cm,然后逐層切開皮下筋膜,分離骨膜至顱骨,以前囪尾側(cè)2 mm、矢狀縫左側(cè)2 mm的左側(cè)大腦皮質(zhì)后肢運(yùn)動區(qū)域為中心,開一直徑為5mm的圓形骨窗,硬膜保持完整。20 g撞擊捶從30cm高的外周套管下落,撞

8、擊已置于骨窗硬膜上的撞桿；撞擊傷后,充分止血即縫合頭皮。治療組則即時在損傷點(diǎn)注射不同濃度的chABC。
　　 結(jié)果:以Feeney自由落體撞擊法建立了重度大鼠TBI模型,為大鼠TBI形成膠質(zhì)瘢痕提供了研究客體。
　　 結(jié)論:用自由落體撞擊法建立腦損傷膠質(zhì)瘢痕形成模型,腦損傷確切,具備膠質(zhì)瘢痕形成的條件。
　　 第二部分、大鼠腦損傷后膠質(zhì)瘢痕的形態(tài)學(xué)確認(rèn)
　　 目的:觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集,并初步確定異常組織

9、膠質(zhì)瘢痕的形成及其范圍。
　　 方法:自由落體撞擊法后,將腦損傷的大鼠飼養(yǎng)1周以上,以予損傷腦組織的瘢痕組織充分生長。分別在大鼠TBI后的第1周、2周及4周三個時間點(diǎn)灌注固定并取出大鼠腦組織,病理學(xué)檢測,確定異常的膠質(zhì)瘢痕組織。
　　 結(jié)果:在三個時間點(diǎn),各組均能清晰呈示出損傷點(diǎn)處的星形膠質(zhì)細(xì)胞異常聚集,與正常腦組織之間邊界清晰,且在TBI后第2周及4周的模型對照組鼠標(biāo)本中,星形膠質(zhì)細(xì)胞的異常聚集程度較1周更加明顯,但2

10、周和4周時間點(diǎn)之間的膠質(zhì)細(xì)胞聚集程度沒有明顯差異變化。相對于模型對照組而言,三個治療組的星形膠質(zhì)細(xì)胞異常聚集明顯減少。
　　 結(jié)論:本實驗條件下,大鼠TBI后的第1周,即出現(xiàn)膠質(zhì)瘢痕；受損傷的腦組織與正常腦組織之間在星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集程度上差別明顯。
　　 第三部分、硫酸軟骨素酶ABC對腦損傷模型膠質(zhì)瘢痕的影響
　　 目的:比較觀察ChABC對腦損傷膠質(zhì)瘢痕的影響。
　　 方法:各組標(biāo)本根據(jù)免疫組化和蛋白印

11、跡的不同要求,分別行4％多聚甲醛灌注和冰凍保存。其中多聚甲醛灌注后的標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟、及常規(guī)免疫組化檢測CSPGs、GFAP分布情況；而用于檢測蛋白印跡的冰凍標(biāo)本,則經(jīng)過蛋白提取和變性、膠的制作、點(diǎn)樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、ECL檢測,暗室曝光等操作后,觀察CSPGs、GFAP表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:模型對照組CSPGs免疫組化染色后的腦損傷組織切片上,可清晰觀察到膠質(zhì)瘢痕組織呈淡黃色,膠質(zhì)組織較正常腦組織染色深,邊界清晰