狼毒乙素和新狼毒素A的藥物代謝及動力學研究.pdf

1、狼毒為傳統草藥,在我國臨床使用已有非常悠久的歷史,廣泛用于治療水腫、惡性腫瘤、白血病、慢性氣管炎、皮膚病、婦科病、肺結核、腸結核、淋巴結核等癥。狼毒乙素(ECB)的化學名為2,4-dihydroxy-6-methoxy-3-methyl-acetophenone,新狼毒素A(NCA)的化學名為(2S,2’S,3S,3’S)-5,5’,7,7’-tetrahydroxy-2,2’-bis(4-hydroxyphenyl)-3,3’-bic

2、hroman-4,4’-dione。二者都是中藥狼毒的主要有效成分,藥理活性已有些報道。藥理學研究表明狼毒乙素對耐藥型和非耐藥型結核桿菌具有明顯抑制作用,是已上市藥物結核靈片的主要有效成分之一。2,4-dihydroxy-6-methoxyl-methylene-3-methyl-acetophenone,一種狼毒乙素的結構類似物,最近被報導具強抗人宮頸癌細胞(Hela-60)活性,IC50值為95ng/mL。體外實驗表明,新狼毒素A具

3、有明顯的抗前列腺癌細胞(LNCaP)活性。而狼毒乙素和新狼毒素A的藥物代謝和動力學(DM/PK)至今尚未見研究。本文先從狼毒大戟與瑞香狼毒根中分離、制備狼毒乙素和新狼毒素A,再采用各種體內外實驗模型對狼毒乙素和新狼毒素A的吸收、轉運、代謝、排泄與動力學的性質進行了較系統的研究。本文的研究結果可為狼毒的臨床應用及相關的新藥研發(fā)提供理論和實驗依據。1、新狼毒素A在MDCK和MDCK-MDR1細胞中的轉運研究新狼毒素A在MDCK和MDCK-M

4、DR1細胞上的轉運實驗表明,新狼毒素A在這兩種細胞中的表觀滲透系數均≤1×10-6cm/s,提示其口服后生物利用度較低。新狼毒素A在MDCK-MDR1細胞單層中的轉運存在顯著的外排現象,并可被P-糖蛋白(P-gp)的經典抑制劑維拉帕米所抑制,表明P-gp參與了新狼毒素A在MDCK-MDR1細胞中的外排轉運,提示外排轉運蛋白P-gp可能是制約其口服生物利用度的主要生理屏障因素之一。以羅丹明123(R123)作為P-gp的探針底物,評價新狼

5、毒素A對P-gp轉運功能的影響,結果表明100μmol/L的新狼毒素A對MDCK-MDR1細胞單層中由P-gp介導的R123外排有顯著的抑制作用,提示新狼毒素A可能為P-gp抑制劑。另一方面,新狼毒素A對MDCK細胞具有比較明顯的細胞毒性,但對MDCK-MDR1細胞的毒性顯著減弱,可能是MDCK-MDR1細胞中高表達的外排蛋白P-gp參與了藥物的外排,減少細胞內的蓄積,使毒性下降,也間接驗證了新狼毒素A是P-gp底物的實驗結果。2、狼毒

6、乙素和新狼毒素A在大鼠肝微粒體和大鼠原代肝細胞中的代謝研究在β-NADPH存在下,狼毒乙素在大鼠肝微粒體中生成一個氧化代謝產物,質譜鑒定其結構是1-(2,4-dihydroxy-6-methoxy-3-methylphenyl)-2-hydroxyethanone,為單羥基化代謝物;在UDPGA存在下,狼毒乙素在大鼠肝微粒體中生成一個單取代葡萄糖醛酸苷,分離后經p-葡萄糖醛酸苷水解酶水解、質譜分析、核磁共振氫譜鑒定其結構為2-hydro

7、xy-6-methoxy-3-methyl-acetophenone-4-O-β-glucuronide。孵育體系中同時加入β-NADPH和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)進行一相、二相級聯代謝共孵育,結果超過80％的狼毒乙素均轉化成單取代葡萄糖醛酸苷,提示狼毒乙素在大鼠體內主要經葡萄糖醛酸化代謝。新狼毒素A在大鼠肝微粒體中不發(fā)生氧化代謝,但在UDPGA存在下生成兩個代謝產物,經葡萄糖醛酸苷水解酶水解和質譜分析,這兩個代謝物均為單取代

8、葡萄糖醛酸苷。狼毒乙素和新狼毒素A在大鼠肝微粒體中發(fā)生的葡萄糖醛酸化代謝及狼毒乙素發(fā)生的氧化代謝均符合米氏動力學方程。綜合應用選擇性化學誘導和抑制實驗,進行篩選,大鼠肝微粒體中催化狼毒乙素代謝的酶主要是CYP3A, CYP2C11, CYP2C6和UGT1A6/9,其中UGT1A6的貢獻更為顯著;催化新狼毒素A葡萄糖醛酸化代謝的酶主要是UGT1A3/6/9。將新狼毒素A與大鼠原代肝細胞共孵育,沒檢測到代謝產物;將狼毒乙素與大鼠原代肝細胞

9、共孵育,檢測有痕量的兩個代謝物,但相對肝微粒體,原代肝細胞的代謝活性要低很多。3、狼毒乙素和新狼毒素A的大鼠體內代謝、排泄和動力學研究狼毒乙素與新狼毒素A大鼠體內主要發(fā)生葡萄糖醛酸化代謝,代謝物分析均只檢測到一個葡萄糖醛酸苷。狼毒乙素體內產生的葡萄糖醛酸苷跟體外產生的葡萄糖醛酸苷結構一致。從色譜保留時間判斷,新狼毒素A體內產生的葡萄糖醛酸苷跟體外鼠肝微粒體產生的兩個中的一個相對應,結構還在鑒定中。對大鼠口服狼毒乙素的動力學行為進行了初步

10、研究,建立了血漿中狼毒乙素葡萄糖醛酸苷測定的UPLC-MS方法。結果顯示,大鼠口服狼毒乙素后,在血漿中只明顯檢測到其單取代葡萄糖醛酸苷。該葡萄糖醛酸苷在大鼠體內的動力學行為符合二室模型,達峰時間約為4小時,提示大鼠口服狼毒乙素后吸收迅速。大鼠口服新狼毒素A后,血漿中沒有檢測到明顯的代謝產物,原形藥物的濃度也非常低,提示大鼠口服新狼毒素A的吸收很差,這與新狼毒素A是P-gp底物有關。4、狼毒乙素和新狼毒素A在人肝微粒體、HepG2細胞及人

11、重組酶中的代謝研究狼毒乙素在人肝微粒體中的代謝結果與鼠肝微粒體中的一致,提示狼毒乙素在人體內主要發(fā)生葡萄糖醛酸化代謝。新狼毒素A在人肝微粒體中只生成了一個單取代葡萄糖醛酸苷。綜合選擇性化學抑制及人重組酶實驗對這兩個底物的代謝活性分析結果,可推測人肝微粒體中參與狼毒乙素代謝的主要酶系是UGT1A6/9、CYP3A4、CYP2C9,其中最主要的是CYP3A4與UGT1A6;參與新狼毒素A代謝的主要酶系是UGT1A3/6/9。狼毒乙素與Hep