大熊貓γ-干擾素基因克隆、原核表達及真核表達載體構(gòu)建.pdf

1、γ-干擾素(IFN-γ)主要是由活化的Thl細胞、CD<,8><'+>T細胞和NK細胞產(chǎn)生，除具有抗病毒和抗腫瘤活性外，免疫調(diào)節(jié)作用是其主要的生物學功能，如：激活巨噬細胞、上調(diào)MHCI、Ⅱ類分子表達水平和促進抗原提呈，誘導Th細胞的分化等，在機體針對腫瘤及多種胞內(nèi)病原體感染等疾病的細胞免疫中發(fā)揮重要的作用，是體現(xiàn)機體免疫功能的一項重要指標。 大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)是我國特有的珍稀野生動物，被譽為中

2、國的“國寶”。據(jù)國家林業(yè)總局最新公布的調(diào)查數(shù)字，野生大熊貓現(xiàn)存數(shù)量在1590只左右，人工圈養(yǎng)的大熊貓也僅有189只，它們?nèi)蕴幱诮^滅的邊緣。長期人工圈養(yǎng)的大熊貓(特別是幼年大熊貓和老齡化大熊貓)大多免疫力低下，抗病毒、細菌和寄生蟲感染的能力相對較弱，對其疾病的防治目前仍以藥物控制為主，并無專用疫苗，加上頻繁用藥導致耐藥性菌(蟲)株出現(xiàn)，以及藥物自身存在的毒副作用，這些都給大熊貓的疾病防治及繁殖工作帶來了很大的難度。因而為進一步搞好大熊貓的

3、飼養(yǎng)管理及疾病控制，就需要研究新的防治技術(shù)，通過細胞因子的作用來提高大熊貓的自身免疫力將可能是一個相對有效的拯救措施之一。 1.本試驗應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，從ConA誘導培養(yǎng)的大熊貓外周血淋巴細胞總RNA中擴增得到大熊貓γ-干擾素基因，并將其克隆到PGEMT載體中。經(jīng)菌落PCR鑒定、序列測定及序列分析，克隆得到的IFN-γ基因開放閱讀框由498個核苷酸組成，編碼一個由166個氨基酸組成的多肽，包括編碼19

4、個氨基酸的信號肽和147個氨基酸的成熟肽。與Genbank中其他哺乳動物的IFN-γ序列比較，它與犬、貓、人、豬、牛、羊、馬、兔、鼠等的核苷酸同源性在57.7％(鼠)～93.2％(犬)之間；IFN-γ編碼氨基酸同源性在46.8％(鼠)～92.8％(犬)之間；進化樹構(gòu)建結(jié)果表明大熊貓與犬的親緣關(guān)系最近。 2.本試驗構(gòu)建了IFN-7基因全編碼序列的原核表達質(zhì)粒pET32aIFN-γ，并進行了原核表達研究。將克隆在PGEMT載體中的I

5、FN-γ基因全編碼序列插入原核表達載體pET32a，得到重組質(zhì)粒pET32aIFN-γ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(表達菌株)，IPTG誘導表達后，裂解菌體作SDS-PAGE分析，得到融合表達蛋白特異條帶，該表達條帶大小為34.6KDa(IFN-γ成熟蛋白為17.4 KDa，菌蛋白為17.2 KDa)。 3.將克隆在PGEMT載體中的IFN-γ基因全編碼序列經(jīng)EcoRI和XhoI酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，采用膠回收試劑盒

6、回收純化酶切產(chǎn)物，然后與同樣酶切的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒定向連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)IFN-γ，并用酶切分析和序列測定進行了鑒定，結(jié)果酶切分析和序列測定都證實真核表達質(zhì)粒成功構(gòu)建。本研究成功克隆了大熊貓IFN-γ基因，構(gòu)建了原核和真核表達質(zhì)粒，并進行了原核蛋白的表達。本研究為了解各物種間干擾素序列的進化關(guān)系提供理論依據(jù)，同時也為進一步研究IFN-γ重組蛋白的免疫學特性和生物學活性及其應(yīng)用奠定了基