氟暴露所致大鼠發(fā)育神經(jīng)毒性和生殖毒性及其機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述:
　　第一部分 葡萄糖利用減少和神經(jīng)退行性改變參與氟暴露引起的大鼠認知損傷
　　目的：氟是一種較活潑的微量元素，除了導致氟骨癥和氟斑牙、引起骨代謝紊亂外，還能對其它非骨相器官產(chǎn)生嚴重的損害。近年來，氟對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育毒性引起了人們的廣泛關注，但其具體的作用機制還不十分清楚。本研究旨在探討氟暴露所致發(fā)育神經(jīng)毒性的潛在發(fā)生機制。
　　方法：將40只清潔級成年Sprague-Dewley（SD

2、）大鼠（雌雄各半）隨機分成四組：對照組（自來水，氟含量低于1mg/L）和25mg/L、50mg/L、100mg/L三個氟化鈉劑量組（氟化鈉溶解于自來水中），自由飲水染毒10天后，雌、雄大鼠按1﹕1合籠，受孕期間繼續(xù)按照上述劑量染毒至仔鼠斷乳（出生后第21天），將所有仔鼠按性別和劑量分開，接受與親代相同的染毒處理，到仔鼠出生后第8周末（出生后第56天）結束。采用Morris水迷宮檢測子代大鼠的空間學習記憶能力；應用小動物磁共振成像（Mag

3、netic resonance imaging，MRI）技術觀察活體大腦形態(tài)學改變；小動物正電子發(fā)射斷層顯像/計算機斷層掃描（Positron emission tomography/Computed tomography，PET/CT）活體檢測腦葡萄糖利用情況；電鏡下觀察海馬超微結構改變；Western blot方法檢測腦功能相關基因葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（glucose transporter1，GLUT1）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brai

4、n-derived neurotrophic factor，BDNF）以及膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的蛋白表達水平。
　　結果：與對照組相比，25mg/L、50mg/L和100mg/L氟暴露均可明顯增加子代大鼠到達平臺的潛伏期和路徑，并顯著降低大鼠在平臺所在象限的游行時間（路徑）和總時間（總路徑）的比值，且各組內(nèi)雌雄之間無性別差異；MRI檢測結果顯示染氟大鼠側(cè)腦室T

5、2加權信號增強，提示染氟大鼠出現(xiàn)腦室擴張；PET/CT成像檢測結果表明，50mg/L和100mg/L兩個染氟組子代大鼠腦葡萄糖利用率明顯降低；電鏡下超微結構顯示氟可導致海馬CA1區(qū)大量空泡化形成、神經(jīng)元顯著變性并發(fā)生脫髓鞘改變；腦功能基因檢測發(fā)現(xiàn)，25mg/L、50mg/L和100mg/L氟處理均可明顯下調(diào)大鼠腦皮層和海馬GLUT1和GFAP的表達水平，并顯著上調(diào)皮層和海馬BDNF的表達水平，上述三個蛋白在相同暴露劑量的雌雄大鼠間的表達

6、水平相近。
　　結論：發(fā)育期氟暴露引起的神經(jīng)毒性與大腦葡萄糖利用減少和神經(jīng)退行性改變密切相關。
　　第二部分 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥反應在氟暴露所致大鼠睪丸損傷中的作用
　　目的：長期過量氟暴露可對機體多種組織器官造成損傷。雖然氟對雄性生殖系統(tǒng)的損傷作用已被確認并備受人們關注，但氟導致生殖毒性的具體作用機制還未完全闡明。本研究通過模擬人群氟暴露方式建立動物氟暴露模型，旨在探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥反應在氟暴露致子代大鼠睪丸損傷中的

7、作用。
　　方法：將40只清潔級成年Sprague-Dewley（SD）大鼠（雌雄各半）隨機分成四組：對照組（自來水，氟含量低于1mg/L）和25mg/L、50mg/L、100mg/L三個氟化鈉劑量組（氟化鈉溶解于自來水中），自由飲水染毒10天后，雌、雄大鼠按1﹕1合籠，受孕期間繼續(xù)按照上述劑量染毒至仔鼠斷乳（出生后第21天），將所有雄性仔鼠按與親代相同的染毒方式處理，到仔鼠出生后第8周末（出生后第56天）結束。應用蘇木精—伊紅（

8、Hematoxylin-eosin staining，HE）染色、原位末端轉(zhuǎn)移酶標記（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）試驗檢測睪丸組織形態(tài)改變及生殖細胞凋亡情況；電鏡下觀察睪丸超微結構改變；采用比色法測定睪丸組織丙二醛（Methane dicarboxylic aldehyde，MDA）含量及超氧化物歧化

9、酶（Superoxide dismutase，SOD）活力；應用Real time PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關分子及促炎癥介質(zhì)的mRNA表達水平；Western blot技術檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志分子及核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）的蛋白表達水平；免疫組織化學檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡調(diào)控分子生長抑制和 DNA損傷同源蛋白153(GADD153/C/EBPhomologous protein，CHOP）以及炎癥調(diào)控

10、因子NF-κB活化亞單位p65的表達和組織定位。
　　結果：與對照組相比，發(fā)育期氟暴露可導致明顯的睪丸組織病理學損傷，主要表現(xiàn)為：子代大鼠睪丸曲細精管萎縮，生精上皮松弛、結構不完整，生殖細胞排列不規(guī)則，嚴重者甚至出現(xiàn)脫落，生殖細胞數(shù)量明顯減少。TUNEL染色檢測發(fā)現(xiàn)50mg/L和100mg/L染氟組睪丸出現(xiàn)不同程度的凋亡，主要以精原細胞和精母細胞凋亡為主。電鏡結果同時也發(fā)現(xiàn)生殖細胞出現(xiàn)核染色質(zhì)濃縮及邊集等典型的凋亡形態(tài)學特征，并可

11、見細胞空泡化改變；大量線粒體出現(xiàn)明顯的腫脹、擴張，嵴斷裂甚至消失等異常形態(tài)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也呈極度的擴張變性改變。生化分析結果表明氟能引起睪丸組織MDA蓄積以及SOD活力降低。進一步分析發(fā)現(xiàn)，25mg/L、50mg/L和100mg/L氟暴露能引起睪丸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和未折疊蛋白反應活化，誘導葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose-regulated protein78，GRP78）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜感應蛋白肌醇需求酶1（Inositol-requiring e

12、nzyme1，IRE1）及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號調(diào)控蛋白 CHOP的基因和蛋白表達，且CHOP的表達和組織分布與凋亡的生殖細胞大體一致。此外，25mg/L、50mg/L和100mg/L氟暴露還能不同程度的上調(diào)睪丸組織炎癥相關介質(zhì)如腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、誘導型的一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide syntha