結核不同感染狀態(tài)下宿主對結核特異性抗原獲得性免疫應答的差異及相關分子標識篩選.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌所致的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。近年來，結核病疫情越來越嚴重，其感染后引起患者的死亡率位居我國傳染病的首位。目前全球約有1/3的人口感染結核桿菌，每年新發(fā)的活動性結核病人有900多萬人，并且每年有近200萬人死于結核病。大多數人感染結核菌后并無臨床癥狀，稱為潛伏感染。但是有10％的潛伏感染者將在其一生的某個階段發(fā)展為活動性結核。潛伏感染不斷轉化為活動性結核，是造成結核病發(fā)病率居高不下的重要原因。因此，潛伏感染

2、者為結核病的控制和診斷帶來了巨大的挑戰(zhàn)。然而，對于機體如何控制潛伏感染，以避免發(fā)展為活動性結核的關鍵免疫機制仍知之甚少，同時臨床亦缺乏鑒別潛伏感染與活動性感染的生物靶標。因此，全面的研究活動性結核與潛伏感染的免疫應答差異對進一步揭開抗結核免疫的機制和發(fā)展新的結核診斷方法具有重要意義，也為提出新型的結核病控制策略奠定基礎。
　　本研究首先用人全基因組表達譜芯片的方法，尋找結核不同感染狀態(tài)者的獲得性免疫在應答PPD刺激時的差異。我們入

3、選了4名活動性結核患者(TB)，4名潛伏感染者(LTBI)及4名未感染結核菌的健康對照者(HC)。采其外周血分離外周血單個核細胞(PBMCs)，用結核特異性抗原PPD刺激培養(yǎng)4小時，設置未刺激的PBMCs作為自身對照，消除本底差異。用雙熒光標記雜交的方法，將來自于同一人的兩份RNA在同一張芯片上進行雜交。對芯片結果的統(tǒng)計分析顯示，TB組和LTBI組的PBMCs對PPD刺激的應答差異最為明顯，我們從中篩選到了286個差異表達基因;TB組與

4、HC組的差異基因數目與上述兩組相當，差異表達基因為239個;LTBI組與HC組的差異最小，差異表達基因為94個。最終，我們通過維恩分析得到了506個在三組組間比較中差異表達的基因群。隨后用生物信息學的方法，我們又對差異表達的基因的功能進行了分析。GeneOntology(GO)分析發(fā)現，胞外組分及應對外來刺激的基因簇在LTBI組與HC組的差異表達基因中被顯著富集;與應對外來刺激相關的基因簇也在TB組與LTBI組間存在差異;TB組與HC組

5、的差異基因簇最多，主要集中在受體結合、信號轉導、胞外組分、應對刺激、免疫系統(tǒng)調節(jié)和細胞通信等幾個方面。
　　隨后，我們又對結核感染者及活動性結核患者的PBMCs在PPD刺激時的特有免疫應答進行研究。我們比較了(1)結核感染者(TB組和LTBI組)與健康對照者（HC組）的PBMCs在應答PPD刺激的差異;(2)活動性結核患者(TB組)與無臨床癥狀者（LTBI組和HC組）的PBMCs在應答PPD刺激的差異。最終我們分別得到了由55個基

6、因所組成的結核感染者的特有的基因表達譜，及由229個基因所組成的活動性結核特有的基因表達譜。GO分析發(fā)現，結核感染表達譜的差異基因在受體結合、應對胞外刺激和細胞增殖調控幾個方面被顯著富集;活動性結核基因表達譜中的229個基因在受體結合、胞外成分、應對胞外刺激、信號轉導、細胞膜結構、慢性炎癥調控和細胞增殖調控幾個方面被顯著富集。
　　為了驗證表達譜芯片的結果，我們進行了實時定量PCR(qPCR)驗證實驗。為此，我們另外招募了83名參

7、與者，其中TB組為25名，LTBI組為36名，HC組為22名。結果顯示，81％的qPCR結果與芯片試驗結果一致，證明了芯片實驗數據可靠。同時，我們在該擴大樣本的驗證中，也得到了一系列在相應組間比較中存在差異表達的基因。
　　基于上述芯片實驗篩選及后續(xù)qPCR擴大樣本驗證中得到的差異表達基因的mRNA表達水平，我們篩選到了新的活動性結核患者及結核感染者的分子標識。ROC及決策樹分析發(fā)現，CXCL10，ATP10A和TLR6三個基因表

8、達水平的聯(lián)合對于區(qū)分TB組和LTBI組的敏感性為80％，特異性為89％。在區(qū)分TB組與無結核臨床癥狀組（LTBI&HC組）方面，我們發(fā)現CXCL10，ATP10A，TLR6，RAB20和IL2幾個基因表達水平的不同的聯(lián)合可以對二者進行較好的區(qū)分。CXCL10，RAB20和IL2三個基因表達水平的聯(lián)合對于區(qū)分TB組和LTBI&HC組的陽性預測值最高，為90％，敏感性和特異性分別為72％和97％;另外，CXCL10，RAB20和ATP10A

9、區(qū)分這兩組的敏感性和特異性為84％和91％;CXCL10，TLR6和ATP10A三個基因聯(lián)合對于區(qū)分TB組和LTBI&HC組的敏感性和特異性為68％和97％。在區(qū)分結核感染者(TB<BI組)與HC組方面，IFN-γ，CXCL10，CXCL9及IL2RA四個基因聯(lián)合的效果良好，敏感性為98％，特異性為59％。
　　綜上所述，通過本研究篩選出的CXCL10，ATP10A，TLR6，RAB20，IL2，IFN-γ，CXCL9及IL2