靶向DC-SIGN的抗原特異性免疫應答研究.pdf

1、盡管疫苗的出現(xiàn)已經(jīng)有效的改善了人類的健康進程，但對疫苗的設計仍有諸多改善的必要，尤其在各種新的感染性疾病層出不窮，癌癥死亡率仍步步攀升的今天。因此，采取新的策略來改善疫苗的免疫原性，設計更為有效的治療性疫苗是當前刻不容緩的問題。 樹突狀細胞(dendriticcells，DCs)是目前已知的功能最強大的職業(yè)抗原呈遞細胞(profesionalantigenpresentingcells，pAPCs)，能以受體介導的內(nèi)吞、巨吞飲和

2、吞噬等方式高效的攝取外界抗原并以多種機制來呈遞抗原；作為一個自然的免疫佐劑，在遭遇危險信號時能高表達CD80、CD83、CD86等共刺激分子，與MHC抗原肽復合物共同作用可有效的活化效應T細胞，并且是唯一能活化na(i)veT細胞的抗原呈遞細胞；在靜息狀態(tài)(steadystate)的DCs細胞仍然可以有效的“抽樣調(diào)查(sample)”外界抗原，并組成性的呈遞(constitutivepresentation)這些無害的外來抗原和自身抗原

3、(30-80％為自身合成缺陷的蛋白)，通過誘導調(diào)節(jié)性T細胞分化來誘導和維持外周耐受；DCs細胞兼具兩種看似矛盾的功能，正是通過它對“自身”和“非自身”抗原的判斷來決定免疫系統(tǒng)的不同反應，在適當?shù)臅r候產(chǎn)生適當?shù)膽鸹蚴悄褪埽瑥亩S持機體免疫穩(wěn)態(tài)；因此，利用DCs細胞來調(diào)控和改善治療性疫苗的免疫效應，上調(diào)或是下調(diào)特定的免疫反應，一貫是治療性疫苗設計的重要方向。 DCs細胞雖然具有強大的攝取抗原的功能，但它對抗原非特異的攝取和呈遞的方

4、式會造成疫苗不能被有效呈遞，從而影響疫苗的后續(xù)效應。將抗原靶向DCs，利用DCs來改善疫苗的免疫原性是重要的疫苗設計策略。隨著分子免疫學和DC細胞生物學的進展，許多在DC特異表達的分子被鑒定，尋找適當?shù)陌邢蛲緩匠蔀橐粋€歷久彌新的重要課題。 新近發(fā)現(xiàn)的一些DC限制性表達的凝集素受體成為目前關(guān)注的靶向新途徑，例如DEC205和DC-SIGN。DC-SIGN(DC-specificintracellularadhesionmolecu

5、le-grabbingnonintegrin)受體是2002年發(fā)現(xiàn)的限制性表達于DC和某些組織巨噬細胞上的凝集素樣受體，DC-SIGN已經(jīng)被證實不僅是病原體受體，而且是重要的抗原受體，可有效的攝取處于粘膜組織的微量的HIV和CMV病毒顆粒，繼之可以MHC-Ⅰ類分子和MHC-Ⅱ類分子限制性方式將抗原高效呈遞出來，用人源化的鼠抗靶向DC-SIGN可以有效誘導na(i)veT細胞和記憶T細胞的免疫反應。綜上，DC-SIGN的發(fā)現(xiàn)為靶向DC的疫

6、苗設計提供了新的思路。 本研究采用DC-SIGN的高親和力自然配體le(x)糖分子作為導向分子，利用生物素-鏈霉親和素交聯(lián)系統(tǒng)將糖分子與卵白抗原(ovalbumin,OVA)連接，由此制備了靶向DC-SIGN的抗原，然后觀察了靶向抗原負載DC之后的對免疫應答能力的影響以及對DC本身功能狀態(tài)的影響。 首先，利用Sulfo-SMCC異源雙功能交聯(lián)試劑交聯(lián)鏈霉親和素(streptavidin，SA)和模式抗原卵白蛋白，通過SD

7、S-PAGE蛋白質(zhì)電泳和Western免疫印跡方法證實SA與OVA蛋白成功交聯(lián)，對電泳膠片的灰度掃描可估計，SA蛋白與OVA蛋白交聯(lián)的分子摩爾比約為2/1；然后，ELISA方法證實SA-OVA復合物中的SA仍具有與生物素反應的功能，根據(jù)SA-OVA復合物與生物素修飾的Le(x)寡糖飽和反應的比例(4.25μg：1μg)，獲得所需要的靶向抗原Le(x)-OVA復合物，1μgLe(x)糖分子飽和反應的SA-OVA復合物中含有約1.5μgOV

8、A蛋白。由此獲得由Le(x)寡糖介導的靶向抗原le(x)-OVA復合物。 其次，在得到靶向DC-SIGN的抗原之后，觀察了靶向抗原是否能被DC-SIGN分子有效的攝取和內(nèi)吞，通過熒光示蹤的方法，le(x)-OVA靶向抗原在15分鐘內(nèi)被有效的攝取到表達DC-SIGN-EGFP綠色熒光融合蛋白的K562細胞中，染色OVA的紅色熒光與綠色熒光有良好的共聚現(xiàn)象產(chǎn)生，抗DC-SIGN的mAb可以有效阻斷K562-DC-SIGN-EGFP對

9、le(x)-OVA的攝取，單核細胞來源的DCs也可在15分鐘內(nèi)高效內(nèi)吞靶向抗原，但阻斷mAb不能完全阻斷原代DCs對le(x)-OVA的攝取，這可能與DCs對外界抗原強大的攝取能力有關(guān)，另外，用于檢測DCs對le(x)-OVA攝取時抗原劑量不合適可能也是其中原因。 然后，通過ELIspot檢測，胞內(nèi)細胞因子染色和標準51Cr釋放實驗，進一步比較了靶向DC-SIGN的抗原和非靶向抗原在誘導抗原特異性免疫應答能力上的差異，研究發(fā)現(xiàn)，

10、靶向DC-SIGN的抗原明顯增強了包括CD8+T細胞的抗原特異性T細胞免疫應答，甚至在劑量低于非靶向抗原1000倍的情況下也能誘導相同水平的IFN-γ+細胞產(chǎn)生，CD40L能有效促進抗原特異性T細胞的活化?？笵C-SIGN的阻斷mAb幾乎完全抑制了靶向DC-SIGN的抗原對效應T細胞的活化，這說明DC-SIGN介導的抗原攝取途徑對抗原的呈遞以及繼之的效應T細胞活化至關(guān)重要，DC-SIGN介導的攝取途徑能促進外來抗原進入高效的抗原呈遞通路

11、，使微量的抗原也能有效呈遞，從而促進抗原特異性T細胞包括CD8+T細胞的活化。 隨著DC細胞生物學的發(fā)展和免疫調(diào)控機制研究的深入，DC細胞在調(diào)控免疫應答和維持免疫耐受方面的貢獻進一步為人們所重視。有理論指出，如果將抗原靶向處于平穩(wěn)狀態(tài)的DC細胞抗原捕獲受體，會導致抗原被組成性呈遞，并誘導抗原特異反應T細胞的缺失和該抗原的重新刺激特異性的無反應性，即使在有強效佐劑的情況下。DC-SIGN受體不僅屬于抗原捕獲受體，更由于可與表達于靜

12、息T細胞上的ICAM-3發(fā)生粘附作用，因此被高度懷疑與免疫耐受有關(guān)。近來有文獻報道DC-SIGN與某些自然配體相互作用可導致DC細胞成熟抑制，抑制性細胞因子IL-10分泌增加和Th1型極化抑制，例如來自于結(jié)核分支桿菌的ManLAM和幽門螺桿菌的含le(x)糖的脂多糖。 這些研究促使我們調(diào)查：在本研究中用于介導抗原靶向DC-SIGN的Le(x)寡糖是否也會在與DC-SIGN發(fā)生相互作用的同時介導某些免疫抑制信號的下傳? 我

13、們檢測了不同組合刺激劑作用后的DC細胞上清，在靶向抗原le(x)-OVA單獨作用和與CD40L協(xié)同作用的DC細胞上清中，沒有觀察到IL-10的分泌增加；但在le(x)-OVA與1-100ng/ml的LPS協(xié)同作用的DC細胞上清中，觀察到有明顯增強的IL-10的分泌，不含le(x)寡糖的OVA和SA-OVA沒有觀察到同樣效應，這說明le(x)-OVA中的le(x)寡糖有促進LPS誘導IL-10分泌的作用；同樣的體系中IL-6也呈現(xiàn)輕度的增

14、加。IFN-γ的分泌沒有明顯變化。另外，作為DC細胞成熟標志之一的CD86分子，不僅在le(x)糖分子單獨作用時沒有明顯的抑制表現(xiàn)，在與LPS同時作用的時候，仍然沒有明顯的表達抑制的現(xiàn)象；DC-SIGN的阻斷抗體不能阻斷l(xiāng)e(x)寡糖分子聚合體與LPS協(xié)同作用下對IL-10分泌的促進作用，它事實上模擬了DC-SIGN配體與DC-SIGN的作用，促進了LPS對IL-10的誘導分泌作用。這說明，le(x)糖分子與DC-SIGN的相互作用并不

15、類似于DC-SIGN與ManLAM之間的相互作用，不會介導DC細胞的成熟抑制和IL-10的分泌。但是，le(x)寡糖單體卻并沒有出現(xiàn)在le(x)-OVA中含有的le(x)寡糖聚合體類似的作用，在與LPS的協(xié)同刺激下，并沒有表現(xiàn)出促進LPS誘導IL-10分泌的作用。DC-SIGN與同樣寡糖分子不同組合形式的不同相互作用以及與不同佐劑之間的不同的協(xié)同作用暗示了一種免疫調(diào)控形式的存在，在適當?shù)拿庖咦魟┳饔孟?，例如CD40L，DC-SIGN受體

16、與配體之間的作用能量也許是下游免疫應答發(fā)生與否至關(guān)重要的決定因素。 本研究結(jié)果表明：將抗原靶向DC-SIGN受體導致1，000倍更有效的抗原特異性T細胞的反應，尤其是CD8+T細胞的應答反應；在合適的免疫佐劑作用下，DC-SIGN與le(x)糖分子聚合體之間的相互作用不會導致DC細胞的成熟抑制及免疫抑制性細胞因子IL-10的分泌增加；利用le(x)糖分子聚合體來介導抗原靶向DC-SIGN受體是一個有效的促進抗原特異性T細胞免疫應