牛精子發(fā)生相關(guān)新基因家族-DAZ基因家族的克隆、序列分析與功能研究.pdf

1、犏牛是牦牛和黃牛遠緣雜交的后代，乳、肉等生產(chǎn)性能顯著優(yōu)于其父母本，然而F1～F2代生精紊亂導致的雄性不育是困擾牦牛雜交改良和育種的難題。國內(nèi)外學者從組織形態(tài)學、生殖內(nèi)分泌學、細胞遺傳學和蛋白多肽等不同方面進行了大量研究，但尚未取得具說服力的、能證實的理論依據(jù)，特別是分子生物學水平上的研究還未見報道。
　　 DAZ基因家族包括DAZ（Deleted in Azoospermia）、DAZL（DAZ-like）和BOULE基因，是精

2、子生成的重要調(diào)控因子。BOULE位于人類的3號染色體上，是DAZ基因家族的祖先基因（ancESTral gene），在動物界的睪丸中表達（蠕蟲除外），調(diào)控精子的正常發(fā)生；DAZL起源于BOULE基因，位于人類2號染色體，在脊椎動物亞門的生殖細胞和胚胎干細胞中表達，迄今研究表明其功能至少是精子生成的重要調(diào)控因子；DAZ基因是DAZL的多拷貝基因，定位于Y染色體上，在人類和舊世界猴中的睪丸中表達，其缺失將導致精子生成停滯。本研究采用電子克隆

3、和克隆測序的方法在世界上首次獲得了牛亞科的DAZ基因家族，分別命名為b-DAZL和b-BOULE。B-DAZL（Genbank（登陸號：EF501823）長2509bp，開放閱讀框為895bp，編碼含295個氨基酸的蛋白質(zhì)。采用電子定位的方法發(fā)現(xiàn)b-DAZL定位在黃牛1號染色體上，具有12個外顯子和11個內(nèi)含子，外顯子與內(nèi)含子連接區(qū)的剪切方式與靈長類DAZL基因外顯子與內(nèi)含子連接區(qū)的剪切方式一致，其可譯框與其它脊椎動物DAZL基因cDN

4、A可譯框的核苷酸相似率為90％～94％，核酸序列相似性搜索發(fā)現(xiàn)，EST數(shù)據(jù)庫中存在與之高度相似的其他種屬的EST序列，如人類（95％）、狗（96％）、小鼠（91％）、褐家鼠（90％）等，且可譯框外顯子的組成，長度和位置也高度保守。B-DAZL蛋白質(zhì)序列同源性比較表明：b-DAZL，與脊椎動物門其他生物的DAZL蛋白有53％～96％的一致率，與哺乳動物及人類的一致率為90％～96％；結(jié)合結(jié)構(gòu)域預測分析發(fā)現(xiàn)，其與棉冠獠狨、普通狨、松鼠猴、獼

5、猴、倭黑猩猩、小鼠狐猴和小鼠等脊椎動物的結(jié)構(gòu)域組成相一致，且蛋白序列長度也是保守的。B-DAZL組織表達譜表明，其具組織表達特異性，僅在黃牛生殖細胞和犏牛卵巢中表達，在精子生成障礙的犏牛睪丸中檢測不到其表達信號，預示b-DAZL可能與牛亞科精子生成有關(guān)，而犏牛睪丸切片表現(xiàn)出的典型DAZL蛋白缺失表型進一步支持了上述推論。B-BOULE基因的cDNA序列長941bp，編碼具293個氨基酸的蛋白質(zhì)。電子染色體定位顯示b-BOULE定位在黃牛

6、2號上，具有10個外顯子和9個內(nèi)含子，外顯子與內(nèi)含子連接區(qū)的剪拼方式與靈長類BOULE基因外顯子與內(nèi)含子連接區(qū)的剪拼方式一致，其可譯框與其他脊椎動物BOULE基因cDNA可譯框的核苷酸相似率為93％～97％，核酸序列相似性搜索發(fā)現(xiàn)，EST數(shù)據(jù)庫中存在與之高度相似的其他種屬的EST序列，如人類（95％）、獼猴（93％）、小鼠（88％）、褐家鼠（76％）等，且其可譯框外顯子的組成，長度和位置也高度保守。B-BOULE蛋白質(zhì)序列同源性比較表明

7、：b-BOULE與脊椎動物門其他生物的BOULE有77％～96％的一致率，與哺乳動物及人類的一致率為93％～96％，并結(jié)合人類、棉冠獠狨、普通狨、松鼠猴、黑猩猩、小鼠狐猴對其進行結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，它們的結(jié)構(gòu)域組成相一致。對b-BOULE進行了組織表達分析發(fā)現(xiàn)，其僅在黃牛生殖細胞和犏牛卵巢中表達，在精子生成障礙的犏牛睪丸中檢測不到其表達信號，預示b-BOULE可能與牛亞科精子生成有關(guān)，而犏牛睪丸切片發(fā)現(xiàn)b-BOULE蛋白缺失的犏牛睪丸具有典