重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對帕金森病模型小鼠體內(nèi)神經(jīng)干細胞增殖的影響.pdf

1、目的:帕金森病(parkinson's disease,PD)是一種多發(fā)于中老年人的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,目前PD的發(fā)病機理仍不清楚,治療機制亦不完善。無論是藥物治療還是外科手術(shù)方法只能部分改善癥狀,無法有效的防治神經(jīng)系統(tǒng)的退行性變性,長期療效并不樂觀。因此探尋無創(chuàng)、避免不良反應(yīng)的新療法是當前神經(jīng)科學研究的熱點。而促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞(endogenous neural stem cells,eNSCs)增殖有助于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的恢復(fù)。

2、側(cè)腦室室下區(qū)(SVZ)是一個重要的神經(jīng)發(fā)生區(qū),它的神經(jīng)發(fā)生能力可保持終生。eNSCs通常處于靜息狀態(tài),腦損傷等刺激后,神經(jīng)干細胞(neuralstem cells,NSCs)有一短暫增殖過程,在該時間窗內(nèi)(在大腦5分鐘時開始出現(xiàn)增殖,SVZ區(qū)在不同的物種增殖達頂峰時間不同,嚙齒類達頂峰的時間為7d-10d)腦缺血損傷后調(diào)控NSCs的增殖,遷移,分化等過程,可能為增強大腦的可塑性提供有效途徑。eNSCs來源于自體,避免了免疫排斥和倫理道德

3、上的爭議,eNSCs在病理狀態(tài)下,例如疾病或損傷,它們急劇擴增,而且分布的范圍非常廣泛。這些增生的細胞趨向于自發(fā)性地代替那些因病理傷害而損失的神經(jīng)組織,但這并不能阻止疾病進展或促使疾病恢復(fù)。所以近來人們正在尋求一些促進eNSCs增殖方法。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive Transcranial Magnetic Stimulation,rTMS)為刺激大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的一種新的、非侵入性、無痛的治療手段,當給予一組或一個序列的脈沖時

4、,能夠調(diào)節(jié)局部或遠隔神經(jīng)元的活動。近年來已作為神經(jīng)和心理疾病如PD、運動失調(diào)和抑郁等疾病的有潛力的治療性工具。研究顯示高頻(＞1 Hz)和低頻(＜1 Hz)都有一定的抗抑郁樣作用,但低頻(＜1 Hz))rTMS的抗抑郁效果更好,臨床應(yīng)用低頻刺激較高頻刺激更安全,然而這種治療性作用的機制尚不清楚。此外亦有實驗表明rTMS可促進海馬eNSCs增殖和腦缺血受損神經(jīng)功能的恢復(fù)。多數(shù)實驗表明,低頻電磁場會促進體內(nèi)和體外神經(jīng)細胞增殖。本實驗的目的是

5、利用MPTP所致的急性PD小鼠模型,觀察1 Hz的rTMS是否能誘導(dǎo)PD小鼠側(cè)腦室室下區(qū)eNSCs的增殖,并用高架十字迷宮(Elevated-plus maze,EPM)觀察干預(yù)1天的PD小鼠是否有情緒障礙。
　　 方法:①動物:封閉群清潔級健康雄性C57BL/6J小鼠由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供,實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。②實驗方法:選用清潔級健康C57BL/6J小鼠72只,8-12周齡,雄性,體重20g左右

6、。背部皮下注射MPTP(15mg/kg,溶于生理鹽水中)4次,每隔2h1次,制作急性小鼠PD模型。隨機將小鼠分為4組:鹽水對照組(NS),PD模型組(PD),假磁刺激組(s-rTMS),磁刺激組(rTMS),rTMS組給予相應(yīng)的rTMS;s-rTMS給予同樣的環(huán)境,但不暴露于磁場下;PD組不給予任何處理;NS組頸背部皮下注射與PD組相同的生理鹽水,在MPTP最后一次注射24小時,在一般行為學和EPM檢測后,將小鼠置于一長圓形器具中,頭部

7、暴露于標準磁頭(最大輸出強度為3.7Tesla)下,磁頭中心對準小鼠頭部正中,距頭頂?shù)母叨葹?.5cm,刺激頻率為1Hz,刺激強度為閾上20％,刺激5個序列,每個序列刺激25次,共125次,每個序列之間休息2 min,分別治療1、3、7天。③實驗評估:rTMS干預(yù)前和干預(yù)后分別進行EPM實驗,對急性PD模型小鼠進行1天的rTMS干預(yù),對其情緒障礙進行評價。在側(cè)腦室的室管膜及其室下區(qū)檢測nestin陽性細胞。
　　 結(jié)果:1、一般

8、行為學觀察:小鼠在每次注射MPTP后很快出現(xiàn)震顫、豎尾、豎毛、后肢張開、步態(tài)不穩(wěn),隨著給藥次數(shù)的增加,其運動減少、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、反應(yīng)遲緩的表現(xiàn)越來越明顯。每次給藥后上述急性中毒癥狀持續(xù)5～6小時,在24小時后基本恢復(fù)。2、EPM:①各實驗組內(nèi)在不同時間點的比較:①NS組、PD組、s-rTMS組和rTMS組:在干預(yù)前及干預(yù)后第1天與第2天,小鼠在開放臂上的時間占總時間的百分比的各時間點間比較均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。②NS組、

9、PD組、s-rTMS組和rTMS組相比,各組之間在干預(yù)前后小鼠在開放臂上的時間占總時間的百分比的各時間點間比較均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。③雖然組內(nèi)比較統(tǒng)計學上無意義,但干預(yù)后的小鼠OT％有較明顯的下降。3、巢蛋白(nestin)免疫組化染色結(jié)果:①NS組與PD組相比:NS組的1、3、7天nestin陽性細胞數(shù)分別為(24.33±5.57)、(22.33±4.50)、(23.00±5.40),PD組1、3、7天nestin陽性細胞數(shù)

10、分別為(25.00±3.90)、(50.50±5.13)、(52.67±7.45),NS組與PD組nestin的陽性細胞數(shù)第1天相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),第3天和第7天相比具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。②PD組與s-rTMS組相比:s-rTMS組1、3、7天nestin的陽性細胞數(shù)分別為(29.00±2.83)、(47.83±4.02)、(53.00±4.98),PD組與s-rTMS組1、3、7天nestin的陽性細胞數(shù)分別進

11、行比較不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。③s-rTMS組與rTMS組相比:rTMS組1、3、7天nestin的陽性細胞數(shù)分別為(51.50±9.40)、(64.33±9.07)、(100.50±13.94),s-rTMS組與rTMS組1、3、7天nestin的陽性細胞數(shù)分別進行比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。④PD組與rTMS組相比:PD組與rTMS組1、7天nestin的陽性細胞數(shù)分別進行比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),第3天

12、比較亦具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。⑤PD組、s-rTMS組與rTMS組nestin的陽性細胞數(shù)組內(nèi)各時間點比較亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。并且細胞數(shù)量隨時間的延長而增加。⑥eNSCs沿一定的路徑逐漸往外遷移,第3天時有一部分遷移到胼胝體,到第7天時有一部分能遷移到大腦皮層。
　　 結(jié)論:①MPTP誘導(dǎo)的急性PD模型能促進eNScs增殖。②rTMS能促進eNSCs增殖。③eNsCs增值具有時間依賴性,1天開始出現(xiàn)增殖,3天