大豆黃酮對雞肝臟卵黃蛋白原基因表達的影響及機制研究.pdf

1、本研究以產蛋后期肉種母雞和海蘭雞胚為實驗模型，采用體內和體外相結合的研究方法，探討大豆黃酮對雞肝臟卵黃蛋白原(vitellogenin，VTG)基因表達的影響及機制。 1、大豆黃酮對產蛋后期母雞生產性能、蛋品質及肝臟中VTG mRNA表達的影響本實驗以換羽后第二次產蛋后期(67周齡)的肉種母雞(矮腳B)為動物模型，研究大豆黃酮對其產蛋性能與肝臟中VTG mRNA表達的影響。實驗選取肉種母雞480只，隨機分為兩組：對照組(C)飼喂

2、基礎日糧，實驗組(Da)在基礎日糧中添喂10mg/kg的大豆黃酮，每組設8個重復。實驗周期為8周，在整個實驗期間采取自由飲水，溫控在22±1℃，光照為每天15小時。每天記錄各組的產蛋數(shù)，在第5周時，收集后三天的種蛋，每組隨機抽取30枚種蛋作蛋品質分析。在第6周末，每組隨機選取10只母雞宰殺后采樣，收集血清、肝臟、卵巢、卵泡、產道等組織樣品進行分析。結果顯示：添喂10 mg/kg大豆黃酮后的母雞，前兩周產蛋率顯著上升(p<0.05)，且整

3、個實驗期間一直維持高產蛋率。蛋品質的分析結果表明：兩組間種蛋平均重量無顯著差異(60.67±0.75g vs 59.56±0.68g)；種蛋的蛋殼厚度(0.32±0.01mm vs 0.35±0.01mm)和蛋殼比重(12.12±0.13％ vs 12.57±0.15％)顯著增加，與對照組相比，分別增加了0.03mm和0.45％(p<0.01和p<0.05)；蛋殼強度有所增加(13.0±0.3 kg/cm<'2> vs 13.4±0.5

4、kg/cm<'2>)，但未達到顯著性水平(p>0.05)；大豆黃酮組種蛋的破蛋率顯著降低，但兩組間畸形蛋比率無顯著差異(p>0.05)；種蛋的Haugh單位(80.98±1.13)顯著提高，比對照組種蛋的Haugh單位(76.98±1.33)提高了4.0個單位(p<0.05)；蛋黃重、蛋清重、蛋黃顏色等指標均無顯著性變化(p>0.05)。添喂大豆黃酮第六周后屠宰母雞，采樣記錄結果表明：與對照組相比，大豆黃酮組母雞的體重、卵巢內大卵泡數(shù)、

5、產道重量均無顯著性變化(p>0.05)。此外，采用RT-PCR方法，以β-actin為內標，檢測母雞肝臟中VTG mRNA的表達變化。結果表明：飼喂大豆黃酮6周后，對產蛋母雞肝臟中VTG mRNA的表達無顯著影響(p>0.05)。 2、大豆黃酮對肝細胞中VTG mRNA及雌激素受體mRNA表達的影響為了避免體內多種因素的影響，我們進一步采用體外分離培養(yǎng)雞胚肝實質細胞，采用無血清培養(yǎng)基來探討大豆黃酮對VTG mRNA表達的影響。

6、 從15胚齡的海蘭雞胚中分離得到肝實質細胞，首先采用含5％的胎牛血清培養(yǎng)液預培養(yǎng)肝細胞，為了去除血清因素的影響，預培養(yǎng)24小時后，撤去培養(yǎng)液，采用無血清的ITs培養(yǎng)基(培養(yǎng)液中添加10μg/mL，胰島素、5μg/mL轉鐵蛋白和3×10<'-8>mol/L亞硒酸鈉)，同時添加大豆黃酮、17 β-estradiol(E<,2>)、tamoxifen(TAM)，以及在不同的雌激素背景下，添加不同劑量的大豆黃酮和/或tamoxifen

7、，處理48小時后收集細胞提取總RNA。采用RT-PCR方法，以β-actin為內標檢測大豆黃酮對肝細胞VTG mRNA及雌激素受體(ERα和ERβ)mRNA表達的影響。結果表明：100μM大豆黃酮在體外無血清培養(yǎng)的條件下，能誘導肝細胞中VTG mRNA的表達；在不同的E<,2>的背景下，大豆黃酮的效應存在差異，在1μM E<,2>的背景下，100μM的大豆黃酮促進肝細胞中VTG mRNA表達，且表現(xiàn)出與雌激素的協(xié)同效應；而在此條件下，添

8、加1μM和10μM的大豆黃酮對肝細胞VTG mRNA表達無顯著性影響(p>0.05)；在10μM E<,2>的背景下，大豆黃酮表現(xiàn)出抗雌激素效應，且具有劑量依賴性。當添加10μM的選擇性雌激素阻斷劑-tamoxifen后，VTG mRNA的表達受到顯著性抑制(p<0.05)。無論培養(yǎng)液中是否添加雌激素，100μM的大豆黃酮對ERα mRNA的表達沒有顯著的影響，而同時添加10μM TAM可顯著上調ERα mRNA的表達，僅10μM TA

9、M也可顯著上調ERαmRNA的表達(p>0.05)。此外，本實驗結果表明，大豆黃酮可以顯著上調ERβ mRNA的表達(p<0.05)，且TAM可以阻斷大豆黃酮上調ERβ基因的表達，而當在有雌激素背景下，ERβ mRNA的表達顯著上調，添加大豆黃酮和/或TAM不能進一步影響ERβ mRNA的表達(p>0.05)。 以上實驗結果表明：大豆黃酮可以顯著提高產蛋后期母雞的產蛋性能，提高蛋殼厚度和蛋的新鮮度。在低雌激素背景下，一定劑量的