羅格列酮對非酒精性脂肪性肝纖維化肝星狀細胞活化及PPARγ、TGFβ1表達的影響.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝纖維化是在非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)的基礎上，各種纖維化相關因子激活導致肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化及表型轉化，產生大量細胞外基質(extracellular matrix，ECM)而形成的。非酒精性脂肪性肝纖維化是NASH進展為肝硬化甚至肝癌的必經階段，但其發(fā)病機制尚未完全清楚，因此，亦缺乏有效逆轉肝纖維化的治療

2、措施，目前有關非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)病機制及防治措施的研究引起國內外學者普遍關注。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)屬于甾體激素類受體超家族中的細胞核受體家族成員，人體內PPARγ在肝臟、肌肉均有表達，PPARγ在脂肪性肝炎/肝纖維化發(fā)病中的作用及其機制目前尚未明確，目前認為PPARγ是維持IISCs靜息狀態(tài)的重要細胞因子，推測

3、PPARγ激活可能具有逆轉活化HSCs恢復靜息狀態(tài)而阻止或延緩肝纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。羅格列酮為PPARγ的特異性激動劑，可通過激活PPARγ實現抗炎、抗纖維化等多種生物學作用。本實驗采用高脂、蛋氨酸-膽堿缺乏(high fat，methionine-choline deficient diet，MCD)飲食建立小鼠脂肪性肝纖維化模型，應用PPARγ激動劑羅格列酮進行干預治療，以免疫組織化學染色方法檢測HSCs活化標志-α-平滑肌肌動蛋

4、白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)表達變化；通過逆轉錄.聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western blot方法研究PPARγ、轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)在脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中的表達情況及其與疾病進展的關系，并觀察羅格列酮干預后PPARγ及TGFβ

5、1表達變化，以明確PPARγ及TGFβ1在脂肪性肝纖維化發(fā)病中的作用，探討羅格列酮延緩或阻止肝纖維化發(fā)生和進展的作用及其機制，為臨床有效治療非酒精性脂肪性肝纖維化提供理論依據。方法：選用8周齡健康雄性C57BL6/J小鼠30只，隨機分為3組，每組10只。模型組采用MCD飼料，對照組給予膽堿、蛋氨酸充足的飼料，羅格列酮干預組應用MCD飼料加羅格列酮(50mg/kg/d)，共喂養(yǎng)8周。血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotran

6、sferase，ALT)，甘油三酯(triglyceride，TG)采用日本Olympus AU 2700全自動生化分析儀測定；采用蘇丹IV染色、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色及Masson染色觀察肝組織病理學改變；肝組織α-SMA表達采用免疫組織化學染色方法檢測；PPARγ、TGFβ1 mRNA和蛋白表達分別采用RT-PCR和Western blot檢測。 結果： 1.動物一般情況：對照組

7、小鼠活潑、毛發(fā)有光澤，體重逐漸增加。模型組和羅格列酮干預組小鼠體重均下降，尤以模型組明顯。對照組、模型組和干預組小鼠體重、肝濕重分別為：38.00±0.60 g、17.60±0.89 g、18.25±0.50 g，1.37±0.35g、0.70±0.07 g、0.73±0.05 g。模型組、羅格列酮干預組小鼠體重、肝濕重較對照組明顯下降(P值均<0.05)，而羅格列酮干預組與模型組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。對照組、模型組和干預組

8、小鼠肝臟指數分別為：3.6±0.8、4.0±0.2、4.0±0.2，各組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 2 血清生化學改變：對照組、模型組和干預組小鼠血清ALT、TG水平依次為：49.67±7.64U/L、591.50±71.60 U/L、270.70±85.05 U/L：0.76±0.29 mmol/L、0.34±0.81 mmol/L、0.47±0.18 mmol/L。模型組小鼠血清ALT顯著高于對照組(P<0.01)，而羅格列

9、酮干預后可明顯降低ALT水平(P<0.01)。各組小鼠血清TG水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 3.肝臟病理學變化：肉眼觀察：對照組小鼠肝臟為紅褐色，明亮有光澤。模型組小鼠肝臟體積明顯減小，整個肝臟呈淺黃色，與周圍組織有粘連，切面油膩、無光澤。羅格列酮干預組小鼠肝臟體積亦有縮小，為紅褐色、有光澤。光鏡觀察：對照組小鼠肝臟肝小葉結構正常，肝板排列整齊；模型組肝細胞彌漫性水樣變，呈現大泡性為主的肝細胞脂肪變，以腺泡3帶明顯，小葉內

10、可見點狀或灶狀肝細胞壞死伴以單個核細胞為主的混合性炎細胞浸潤，可見少量分葉核白細胞。匯管區(qū)及竇周可見大量纖維組織增生，形成纖維間隔分割肝小葉(F3～4G2～3S3～4)。羅格列酮干預組小鼠肝損傷較模型組明顯減輕，脂肪變肝細胞明顯減少，炎癥、壞死及纖維化程度明顯減輕(F0～1G1～2S1)。 4 肝組織α-SMA的表達變化：對照組小鼠肝組織α-SMA僅在小動脈壁上有表達：與對照組相比，模型組肝臟α-SMA陽性細胞數明顯增多，大量H

11、SCs胞漿表達α-SMA(0.50±0.05vs.1.57±0.05，P<0.01)；羅格列酮干預組α-SMA陽性細胞數較模型組明顯減少(1.57±0.05 vs.1.07±0.06，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。 5 肝組織PPARγ mRNA的表達：與對照組相比，模型組PPARγ mRNA表達明顯下降(0.73±0.17 vs.0.53±0.08，P<0.05)，而羅格列酮干預組表達較模型組明顯上調(0.53±0.08vs.0

12、.71±0.14，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。 6 肝組織PPARγ蛋白表達情況：與對照組相比，模型組PPARγ蛋白表達明顯下降(0.39±0.01 vs.0.27±0.01，P<0.05)，而羅格列酮干預組表達較模型組明顯增加(0.27±0.01 vs.0.57±0.01，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。 7 肝組織TGFβ1 mRNA表達情況：與對照組相比，模型組TGFβ1 mRNA表達顯著增加(0.32

13、±0.01 vs.0.89±0.01，P<0.01)，而羅格列酮干預組表達較模型組明顯下降(0.89±0.01 vs.0.46±0.05，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。 8 小鼠肝組織TGFβ1蛋白表達情況：與對照組相比，模型組TGFβ1蛋白表達顯著增加(0.55±0.01 vs.1.15±0.00，P<0.01)，而羅格列酮干預組表達較模型組明顯下降(1.15±0.00vs.0.93±0.01，P<0.05)，差異具有統(tǒng)

14、計學意義。 結論： 1.高脂、蛋氨酸-膽堿缺乏飲食8周可誘導典型的非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型，此模型造模時間短，模型復制率高，病理改變符合人類脂肪性肝纖維化特點。 2.脂肪性肝纖維化模型中肝組織活化的HSCs明顯增多，PPARγ表達明顯減少，推測減少的PPARγ不能維持HSCs靜息狀態(tài)而致活化的HSCs數量增多，參與肝纖維化形成。模型組小鼠肝臟TGFβ1表達明顯增加，具有促進HSCs活化及肝纖維化形成的作用。