大豆抗原蛋白對仔豬腸道的致敏作用及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、大豆中的抗原蛋白能引起機體發(fā)生過敏反應，不僅威脅人類的健康，也給畜禽業(yè)造成巨大的經濟損失。本試驗通過高純度的大豆抗原蛋白致敏仔豬，研究大豆抗原蛋白對仔豬腸道的致敏作用，同時建立一種仔豬大豆抗原蛋白血清抗體間接酶聯免疫吸附反應(ELISA)的檢測方法，以期為動物大豆抗原蛋白致敏提供臨床診斷方法。
　　大豆抗原蛋白對仔豬腸道的致敏作用。試驗采取完全隨機設計，將30頭臨床檢查健康的21日齡斷奶仔豬隨機分為3個組，每組10頭，分別為對照組

2、、大豆球蛋白(11S)致敏組和β-伴大豆球蛋白(7S)致敏組。在仔豬21～27日齡與32～34日齡時，分別進行初次致敏和再次致敏。其中，11S和7S致敏組，在基礎日糧中分別添加4％的11S蛋白和4％的7S蛋白（純度分別為80％和85％）。在仔豬21、28和35日齡時，用EDTA抗凝管進行前腔靜脈采血，用于ELISA試劑盒測定血漿D-乳酸、二胺氧化酶和5-羥色胺含量水平;在仔豬35日齡時，進行皮膚致敏試驗;在36日齡時，每組隨機選擇5頭仔

3、豬屠宰，取十二指腸近端、空腸近端、空腸中段、空腸遠端、回腸遠端各6 cm，用免疫組化方法測定分泌型IgA陽性表達分布及強弱。
　　仔豬大豆抗原蛋白血清抗體間接ELISA檢測方法的建立。試驗分組及處理方法同上。在21、28和35日齡時，每天上午7:00～8:00對所有試驗仔豬空腹采血，室溫靜置2h后，3000 r·min-1離心10 min，分離血清，并在35日齡時做皮膚致敏試驗。采用棋盤滴定法確定最佳抗原包被質量濃度及血清稀釋倍數

4、，并對其他條件進行優(yōu)化，建立檢測血清大豆抗原蛋白11S、7S抗體的間接ELISA方法，確立待測血清判定標準，并對建立的ELISA方法進行重復性、準確性和敏感性檢測。
　　試驗結果如下:
　　1.皮膚致敏試驗后，所有致敏組仔豬11S和7S蛋白注射點皮膚反應均較明顯，評判結果在“+”級以上，7S蛋白致敏組仔豬的反應尤為明顯，評判結果達到“++”級以上，證明大豆抗原蛋白可使35日齡仔豬產生過敏反應。
　　2.在28和35日齡

5、時，大豆抗原蛋白致敏組仔豬血漿D-乳酸含量水平、二胺氧化酶活力和5-羥色胺含量水平與對照組相比顯著升高(P＜0.01)，結果表明血漿D-乳酸含量水平和二胺氧化酶活性與腸道損傷具有很強的相關性。對大豆抗原蛋白致敏仔豬血漿5-羥色胺含量進行檢測，發(fā)現5-羥色胺在機體內隨著日齡的增加呈先低后高再低的趨勢，腸道生理功能的強弱與血漿5-羥色胺含量變化有一定的關系。
　　3.試驗用免疫組化的方法，分別對仔豬的十二指腸、空腸近端、空腸中段、空腸

6、遠端和回腸遠端的分泌型IgA陽性表達分布及強弱進行比較，發(fā)現空腸中段陽性分布和光密度值明顯高于其他各試驗組腸段，7S致敏組仔豬陽性表達強度尤為明顯，其次是11S致敏組。小腸5段腸管中分泌型IgA陽性表達光密度值從強到弱依次為:空腸中段＞十二指腸＞空腸近端、回腸遠端＞空腸遠端。
　　4.建立了仔豬血清大豆抗原蛋白間接ELISA檢測方法。其中，11S蛋白的最適包被質量濃度為2.0μg·mL-1，包被作用時間為37℃下2h;封閉液為10

7、 g·L-1BSA，37℃封閉1 h;待測血清最適稀釋度為1∶1600，37℃作用1 h;酶標抗體最適稀釋度為1∶1500，37℃作用1 h;最佳顯色時間15min。7S蛋白的最適包被質量濃度為2.5μg·mL-1，包被作用時間為37℃下2h;封閉液為10 g·L-1 BSA，37℃封閉1h;待測血清最適稀釋度為1∶1600，37℃作用1h;酶標抗體最適稀釋度為1∶1500，37℃作用1h;最佳顯色時間25 min。11S和7S抗原蛋白

8、間接ELISA檢測方法的批內、批間變異系數均小于10％，重復性較好，靈敏度較高。
　　5.在臨床上對已建立的間接ELISA方法進行敏感性和準確性檢測，并確定11S抗原蛋白抗體的間接ELISA方法敏感性為87.5％(7/8)，準確性為81.3％(13/16);7S抗原蛋白抗體的間接ELISA方法敏感性為87.5％(7/8)，準確性為87.5％(14/16)。
　　試驗表明，大豆抗原蛋白對仔豬腸道具有致敏作用，并能改變腸道的正常