氯霉素全抗原合成的研究及間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、氯霉素是第一個人工合成的廣譜抗生素，因其效高價廉，在我國畜牧業(yè)中得到廣泛應用，對畜禽疾病的控制和治療起到了重要的作用。隨著氯霉素的廣泛應用及研究的深入，發(fā)現(xiàn)其有許多毒、副作用，因此，必須控制氯霉素在動物性食品中的殘留，保障消費者健康與安全。 本文分兩部分，第一部分將氯霉素(CAP，Chloramphenicol)與牛血清白蛋白((BSA)、卵清白蛋白(OVA)利用優(yōu)化的重氮化法、混合酸酐法、碳化二亞胺法進行偶聯(lián)及鑒定，分別作為免

2、疫抗原及包被抗原，免疫抗原注射免疫新西蘭大白兔獲得多抗血清。第二部分建立了快速檢測氯霉素的間接競爭ELISA方法，并通過實驗，對檢測過程中的各項條件進行優(yōu)化。 分別應用重氮化法、混合酸酐法、碳化二亞胺法將CAP與載體蛋白BSA偶聯(lián)制備人工合成抗原，以此作為免疫抗原，同法合成包被抗原。它們的紫外掃描光譜、SDS-PAGE電泳、動物免疫試驗均表明偶聯(lián)成功。免疫2～3月齡新西蘭大白兔，獲得多抗CAP抗血清，用間接非競爭ELISA法測定

3、抗血清效價。數(shù)據(jù)顯示，混合酸酐法在合成氯霉素人工抗原方面較優(yōu)于其他兩種方法。本試驗用過碘酸鈉改良法制備辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔抗體，用辛酸—硫酸銨法、Sephadex-G-25、DEAE離子交換提純純化血清IgG，經(jīng)計算結(jié)合物中各項指標，表明酶標抗體標記成功，并且通過SDS-PAGE電泳和直接ELISA測定也可得出酶標抗體標記成功。 采用混合酸酐法制得的免疫抗原免疫兔子得到的抗血清進行間接競爭ELISA實驗，優(yōu)化EL

4、ISA工作條件，建立了間接競爭ELISA檢測CAP方法。方陣滴定法確定理想OVA-HS-HSA包被抗原的濃度為1.25μg/mL，酶標二抗(羊抗兔IgG-HRP)工作濃度為1：400以及多抗(SM2-PcAb)血清的工作濃度為1：12800。以上述實驗條件為基礎(chǔ)，以系列稀釋的CAP標準溶液作為檢測對象，繪制標準曲線，得到的線性回歸直線方程為y=1.069-0.2633x，相關(guān)系數(shù)R2=0.9867，從標準曲線可以得知，此方法可測定的最適

5、范圍為10ng/mL～200ng/mL，最小檢測限約為0.001pg/mL。 本實驗所建立的ELISA方法的精確度以批內(nèi)誤差(孔間差異)和批間誤差(板間差異)表示，結(jié)果表明孔間差異和板間平均差異分別為4.24﹪和9.20﹪，這表明方法精確度較好。添加回收率實驗測得氯霉素對雞肉樣本在10～100ng/mL范圍內(nèi)的平均回收率為94.86﹪±9.55﹪。在可測定濃度范圍內(nèi)，氯霉素(CAP)抗血清與磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethaz