mir-370在Stat3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下通過(guò)WTX促進(jìn)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、腎母細(xì)胞瘤是小兒最常見的惡性實(shí)體腫瘤，在小兒外科疾病中占重要的地位。但是，至今腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制仍然不明確。因此，深入探索腎母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)理，對(duì)尋找新的治療方法和提高患兒的生存率，具有重要的臨床價(jià)值和意義。Stat3（Signal transducer and activator of transcription protein3，Stat3）作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子家族的重要成員與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，但S

2、tat3在腎母細(xì)胞瘤中的作用及其機(jī)制目前知之甚少。本研究通過(guò)對(duì)腎母細(xì)胞瘤腫瘤標(biāo)本和腫瘤細(xì)胞的系統(tǒng)研究，探討Stat3在腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步闡明Stat3對(duì)腎母細(xì)胞瘤的作用機(jī)制，以期為腎母細(xì)胞瘤的生物治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 Stat3在腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞活力和增殖的影響
　　目的：檢測(cè)Stat3在腎母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)，并觀

3、察Stat3對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株G401細(xì)胞活力和增殖的影響，以了解Stat3信號(hào)通路在人腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用。
　　方法：將22例腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織及其瘤旁組織行定量PCR和Western blot，以測(cè)定Stat3的表達(dá)量。在G401細(xì)胞中以IL-6誘導(dǎo)Stat3活化或?qū)A-Stat3真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染G401細(xì)胞，然后運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)和BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G401細(xì)胞活力和增殖情況。反之，以針對(duì)Stat3的

4、siRNAs阻斷Stat3信號(hào)通路，然后運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)和BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G401細(xì)胞活力和增殖情況。
　　結(jié)果：Stat3 mRNA和蛋白在所有腫瘤組織中的表達(dá)率為100％，并且比瘤旁正常組織高表達(dá)(P＜0.05)。在G401細(xì)胞中以IL-6誘導(dǎo)Stat3活化或?qū)A-Stat3真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染G401細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Stat3高表達(dá)，腫瘤細(xì)胞活力和增殖能力增強(qiáng)(P＜0.05)。反之，以針對(duì)Stat3的siRNA阻斷St

5、at3信號(hào)通路后，細(xì)胞內(nèi)Stat3受抑制，腫瘤細(xì)胞活力和增殖能力降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：Stat3在人腎母細(xì)胞瘤中有廣泛的表達(dá)，Stat3與腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的活力和增殖等諸多方面均有密切聯(lián)系。
　　第二部分 腎母細(xì)胞瘤中Stat3轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-370的表達(dá)
　　目的：探討在腎母細(xì)胞瘤中Stat3對(duì)miR-370的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及其分子機(jī)制。
　　方法：以IL-6誘導(dǎo)活化G401細(xì)胞中的Stat3，然后利

6、用miRNAs芯片篩選差異性miRNAs。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域含有Stat3結(jié)合位點(diǎn)的差異性miRNA。在G401細(xì)胞中以IL-6誘導(dǎo)Stat3活化或?qū)A-Stat3真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染G401細(xì)胞使Stat3過(guò)表達(dá)，反之，以針對(duì)Stat3的siRNA阻斷Stat3信號(hào)通路，然后運(yùn)用定量PCR測(cè)定miR-370的表達(dá)。將22例腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織及其瘤旁組織行定量PCR以測(cè)定miR-370的表達(dá)，并分析Stat3和m

7、iR-370表達(dá)間的相關(guān)性。應(yīng)用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、染色體免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤中Stat3轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-370表達(dá)的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：選擇差異倍數(shù)三倍以上、P值＜0.05的差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行聚類分析。在Stat3經(jīng)IL-6誘導(dǎo)活化的G401細(xì)胞中，表達(dá)上調(diào)的miRNAs共5個(gè)，表達(dá)下調(diào)的miRNA共4個(gè)。生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-370編碼基因啟動(dòng)子區(qū)域有Stat3的結(jié)合位點(diǎn)。在G401細(xì)胞中以IL-6誘導(dǎo)S

8、tat3活化或?qū)A-Stat3真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染G401細(xì)胞使Stat3過(guò)表達(dá)，定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-370的表達(dá)增高。反之，以針對(duì)Stat3的siRNA阻斷Stat3信號(hào)通路，定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-370的表達(dá)降低。將22例腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織及其瘤旁組織行定量PCR，結(jié)果表達(dá)miR-370在腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織中高表達(dá)并且與Stat3的表達(dá)呈正相關(guān)。在G401細(xì)胞中將CA-Stat3和報(bào)告質(zhì)粒PGL4-370.WT共

9、轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G401細(xì)胞中Stat3高表達(dá)后，報(bào)告質(zhì)粒PGL4-370.WT的熒光活性增強(qiáng)(P＜0.05)，表明Stat3能夠靶定miR-370，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控其表達(dá)。在G401細(xì)胞中以IL-6誘導(dǎo)活化Stat3或以siRNAs沉默Stat3后進(jìn)行ChIP-PCR，結(jié)果顯示miR-370的引物能使Stat3組擴(kuò)增較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)或下降(P＜0.05)，Stat3能與編碼miR-370的DNA

10、片段在其啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合而調(diào)控miR-370的轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)論：MiR-370在腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織中高表達(dá)，并且與stat3的表達(dá)呈正相關(guān)。MiR-370是Stat3潛在的靶基因，Stat3在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)miR-370進(jìn)行調(diào)控。
　　第三部分 miR-370對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力和增殖的影響及其機(jī)制
　　目的：分析miR-370在腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，預(yù)測(cè)及鑒定miR-370的靶基因，明確其對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力和增殖的

11、影響。
　　方法：在G401細(xì)胞中以miR-370模擬物（miR-370 mimic）或miR-370抑制物(miR-370 inhibitor)將miR-370過(guò)表達(dá)或沉默后，運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)和BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G401細(xì)胞活力和增殖，流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期分布情況;同時(shí)，運(yùn)用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。利用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-370的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行miR-370靶基因的功能

12、富集分析和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析。然后，應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析miR-370與其潛在靶基因WTX相互作用的機(jī)制。在G401細(xì)胞中以miR-370 mimic或miR-370 inhibitor將miR-370過(guò)表達(dá)或沉默后，采用定量PCR和Western blot在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平評(píng)判miR-370對(duì)WTX的調(diào)控作用。最后，在G401細(xì)胞中以siRNAs靶向沉默WTX后，運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)和BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G401細(xì)胞活力和增殖情況。

13、r>　　結(jié)果：G401細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-370 mimic后，MTT實(shí)驗(yàn)和BrdU實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞活力和增殖增強(qiáng)(P＜0.05); FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)處于S期的細(xì)胞增多(P＜0.05); Western blot顯示能夠阻止細(xì)胞通過(guò)G1/S期限制點(diǎn)而進(jìn)入S期的p21和p27蛋白表達(dá)降低、而促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的CyclinD1蛋白表達(dá)增多。反之，G401細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-370inhibitor后，上述實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力和增殖降低(P＜0.0

14、5)、處于S期的細(xì)胞減少(P＜0.05)、p21和p27蛋白表達(dá)增多、CyclinD1蛋白表達(dá)減少。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)WTX為miR-370的靶基因，熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-370可通過(guò)WTX的3'-UTR區(qū)域抑制WTX的轉(zhuǎn)錄(P＜0.05)。DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因功能富集分析和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析提示miR-370可調(diào)控細(xì)胞周期。SiRNA靶向沉默WTX后細(xì)胞活力和增殖增強(qiáng)(P＜0.05)，說(shuō)明對(duì)WTX進(jìn)行RNA干擾，能夠取得與

15、過(guò)表達(dá)miR-370一致的生物學(xué)效應(yīng)，證明miR-370能夠通過(guò)抑制WTX影響腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力和增殖。
　　結(jié)論：miR-370通過(guò)抑制靶基因WTX提高腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞周期分布。由此可見，miR-370在Stat3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下通過(guò)WTX促進(jìn)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。深入探討Stat3/miR-370/WTX調(diào)節(jié)軸在腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，不僅能夠深化我們對(duì)腎母細(xì)胞瘤的認(rèn)識(shí)，也將有助于確定Stat3和miR