miR-221促進N-myc表達對神經(jīng)母細胞瘤增殖的作用與機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　N-myc擴增與神經(jīng)母細胞瘤（Neuroblastoma，NB）惡性表型和快速進展密切相關(guān)，然而促發(fā)N-myc擴增的機制尚未闡明。文獻報道，微小RNA-221（microRNA-221，miR-221）在N-myc擴增的NB中表達上調(diào)。本課題以miR-221為切入點，結(jié)合臨床病例，分析miR-221在NB中的表達，及與N-myc表達和患者臨床病例特征的相關(guān)性，通過NB細胞的體內(nèi)外實驗，探討miR-221對NB細胞

2、增殖的影響及對N-myc表達的調(diào)控機制。
　　方法：
　　1.miR-221在NB中的表達及其與N-myc表達和臨床病例特征相關(guān)性分析：收集31例NB患兒病例資料及石蠟切片，鎖核酸原位雜交（Locked nucleic acid-in situ hybridization，LNA-ISH）和實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測NB組織中miR-221表達，免疫組化檢測

3、NB組織中N-myc表達，分析miR-221與N-myc表達和NB臨床病例特征的相關(guān)性；qRT-PCR和Western blot檢測四種NB細胞系（SH-SY5Y、SK-N-SH、SK-N-DZ和IMR-32）中miR-221、N-myc表達。
　　2.miR-221對NB增殖的影響：構(gòu)建miR-221過表達慢病毒載體并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達和對照載體的細胞株（分別命名為miR-221-up和control細胞），qRT-PCR檢測m

4、iR-221的表達水平，CCK8法和克隆形成實驗檢測細胞增殖能力，流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化；將SH-SY5Y，control及miR-221-up細胞分別接種至裸鼠背部皮下，建立裸鼠移植瘤模型，動態(tài)觀察移植瘤的生長，測量瘤體重量和體積，Ki67染色檢測移植瘤細胞增殖能力。
　　3.miR-221促進N-myc擴增的分子機制：qRT-PCR和Western blot檢測SH-SY5Y，control及miR-221-up細胞和移植

5、瘤中NLK，LEF1，p-LEF1，N-myc mRNA和蛋白的表達，免疫熒光檢測細胞中 NLK，p-LEF1，N-myc蛋白的表達，免疫組化檢測移植瘤中NLK，p-LEF1，N-myc蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR和LNA-ISH結(jié)合免疫組化結(jié)果顯示miR-221在N-myc高表達的NB組織中表達顯著增多（p＜0.05）；臨床病例統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)miR-221表達與NB患兒生存時間成負相關(guān)，miR-221高表

6、達者生存時間短（p=0.0425）；但miR-221表達水平與NB患兒年齡、性別、腫瘤大小、分化、轉(zhuǎn)移與腫瘤分期無關(guān)（p＞0.05）；qRT-PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與SH-SY5Y細胞相比，SK-N-DZ和IMR-32細胞中miR-221表達，N-myc的mRNA和蛋白表達均顯著增高（p＜0.05），而SK-N-SH細胞無顯著變化（p＞0.05）。
　　2.成功構(gòu)建miR-221過表達慢病毒載體；與SH-SY5

7、Y細胞相比，miR-221-up細胞中miR-221表達升高約7倍（p＜0.05）；CCK8和克隆形成實驗結(jié)果顯示miR-221-up細胞的增殖能力較SH-SY5Y細胞明顯增強（p＜0.05）；流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)miR-221-up細胞較SH-SY5Y細胞G0/G1期細胞比例明顯減少（p＜0.05），S期細胞比例顯著增多（p＜0.05）；與 SH-SY5Y細胞注射組相比，miR-221-up細胞注射組裸鼠移植瘤的體積和重量顯著增加（p＜

8、0.05）；Ki67結(jié)果表明 miR-221-up細胞注射組Ki67陽性細胞較SH-SY5Y細胞注射組明顯增多（p＜0.05）。
　　3.與SH-SY5Y細胞相比，qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-221-up細胞中N-myc的mRNA明顯增加（p＜0.05），而NLK和LEF1無顯著變化（p＞0.05），Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示，miR-221-up細胞中NLK和p-LEF1蛋白表達均明顯減少（p＜0.05），N-

9、myc蛋白表達明顯增加（p＜0.05），而 LEF1蛋白表達無明顯變化（p＞0.05）；與 SH-SY5Y細胞注射組相比，qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-221-up細胞注射組中N-myc的mRNA明顯增加（p＜0.05），而NLK和LEF1無顯著變化（p＞0.05）， Western blot和免疫組化發(fā)現(xiàn)miR-221-up細胞注射組移植瘤中NLK和p-LEF1蛋白表達均明顯降低（p＜0.05），N-myc蛋白表達明顯增多（p＜0.0