載端粒酶ASODN-t的殼聚糖納米粒的制備和對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染.pdf

1、目的：優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，制備合適的殼聚糖納米粒，并連接上pEGFP-C<,1>質(zhì)粒，研究殼聚糖納米粒對(duì)DNA的結(jié)合和保護(hù)能力，利用培養(yǎng)的HepG-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，評(píng)估其轉(zhuǎn)染性，比較殼聚糖納米粒與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染率。再連接上端粒酶ASODN-t，轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞，對(duì)比陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，分別觀察HepG-2細(xì)胞的凋亡情況。 方法： 以離子交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒，并送激光微粒度儀及掃描電子顯微鏡檢測(cè)，了解粒徑的分布和形

2、態(tài)；通過(guò)靜電吸附作用連接上增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C<,1>(報(bào)告基因)；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析載體與DNA結(jié)合力，并通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其載藥量和包埋率；紫外分光度計(jì)法，檢測(cè)納米粒體外釋放pDNA；通過(guò)DNase Ⅰ消化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)殼聚糖納米粒對(duì)DNA的保護(hù)作用；以陽(yáng)離子脂質(zhì)體為對(duì)照，利用培養(yǎng)的HepG-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)熒光顯微鏡觀察其基因轉(zhuǎn)染的可行性并比較其轉(zhuǎn)染效率。連接上端粒酶ASODN-t，以陽(yáng)離子脂質(zhì)體為對(duì)照，

3、利用培養(yǎng)的HepG-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)倒置顯微鏡、透射電鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及凋亡情況；通過(guò)DNA抽提及電泳，檢測(cè)細(xì)胞的凋亡帶；通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，并比較其凋亡率；通過(guò)MTT法，描繪出生長(zhǎng)曲線；通過(guò) TRAP-ELISA法，測(cè)定端粒酶活性。 結(jié)果： 1．微粒度儀及電鏡檢測(cè)證實(shí)殼聚糖納米粒呈均勻分散的球形顆粒，最小粒徑50nm，d(0.5)∶95nm。 2．瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示殼聚糖納米粒能有效結(jié)合增強(qiáng)型綠

4、色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C<,1>。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不同比例結(jié)合(納米粒：質(zhì)粒)pEGFP-C<,1>質(zhì)粒的殼聚糖納米粒的包埋率分別為：100％(50∶10)，100％(50∶25)，100％(50∶50)，(92±2．3)％(50∶75)，(69±2．2)％(50∶100)。 3．納米粒體外釋放pDNA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：殼聚糖納米粒釋藥包括較快釋放和平緩釋放兩個(gè)過(guò)程。在1-72h即釋藥達(dá)總量的(75.4±1.8)％，為較

5、快釋放過(guò)程。在72-168h釋放較為緩慢，釋藥達(dá)總量的(94.6±1.4)％為平緩釋放過(guò)程。 4．DNase Ⅰ消化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：未加納米粒及按5∶50的比例加入納米粒處理的，在凝膠上無(wú)明顯的DNA條帶；而按50∶50，100∶50的比例處理的，均顯示明顯的DNA條帶，顯示殼聚糖納米粒在此種比例下有良好的DNA保護(hù)作用。 5．熒光顯微鏡檢測(cè)顯示：用連接上pEGFP-C<,1>質(zhì)粒的殼聚糖納米粒30ul去轉(zhuǎn)染時(shí)的轉(zhuǎn)染率(

6、58.6±2.6)％高于Lipofectamin的轉(zhuǎn)染率(45.5±2.5)％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)有顯著性差異。 6．透射電鏡觀察顯示：以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導(dǎo)的端粒酶ASODN-t轉(zhuǎn)染的HepG-2細(xì)胞均有發(fā)生凋亡樣改變的細(xì)胞。 7．DNA抽提及電泳顯示：以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導(dǎo)的端粒酶ASODN-t轉(zhuǎn)染的HepG-2細(xì)胞均有凋亡帶。 8．流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的結(jié)果顯示：殼聚糖納米

7、粒介導(dǎo)的的凋亡率大于Lipofectamin介導(dǎo)的凋亡率，有顯著差異。 9．對(duì)細(xì)胞抑制作用的觀察顯示：以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導(dǎo)的端粒酶ASODN-t轉(zhuǎn)染的HepG-2細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，其中以殼聚糖納米粒介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)更為緩慢，有顯著差異。 10．TRAP-ELISA法測(cè)定端粒酶活性的結(jié)果顯示：以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導(dǎo)的端粒酶ASODN-t轉(zhuǎn)染72h的HepG-2細(xì)胞的端粒酶活性