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認(rèn)證信息
認(rèn)證類型:個(gè)人認(rèn)證
認(rèn)證主體:常**(實(shí)名認(rèn)證)
IP屬地:河北
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1、目的:優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,制備合適的殼聚糖納米粒,并連接上pEGFP-C<,1>質(zhì)粒,研究殼聚糖納米粒對(duì)DNA的結(jié)合和保護(hù)能力,利用培養(yǎng)的HepG-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,評(píng)估其轉(zhuǎn)染性,比較殼聚糖納米粒與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染率。再連接上端粒酶ASODN-t,轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞,對(duì)比陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,分別觀察HepG-2細(xì)胞的凋亡情況。 方法: 以離子交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒,并送激光微粒度儀及掃描電子顯微鏡檢測(cè),了解粒徑的分布和形
2、態(tài);通過(guò)靜電吸附作用連接上增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C<,1>(報(bào)告基因);經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析載體與DNA結(jié)合力,并通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其載藥量和包埋率;紫外分光度計(jì)法,檢測(cè)納米粒體外釋放pDNA;通過(guò)DNase Ⅰ消化實(shí)驗(yàn),檢測(cè)殼聚糖納米粒對(duì)DNA的保護(hù)作用;以陽(yáng)離子脂質(zhì)體為對(duì)照,利用培養(yǎng)的HepG-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,通過(guò)熒光顯微鏡觀察其基因轉(zhuǎn)染的可行性并比較其轉(zhuǎn)染效率。連接上端粒酶ASODN-t,以陽(yáng)離子脂質(zhì)體為對(duì)照,
3、利用培養(yǎng)的HepG-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)倒置顯微鏡、透射電鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及凋亡情況;通過(guò)DNA抽提及電泳,檢測(cè)細(xì)胞的凋亡帶;通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率,并比較其凋亡率;通過(guò)MTT法,描繪出生長(zhǎng)曲線;通過(guò) TRAP-ELISA法,測(cè)定端粒酶活性。 結(jié)果: 1.微粒度儀及電鏡檢測(cè)證實(shí)殼聚糖納米粒呈均勻分散的球形顆粒,最小粒徑50nm,d(0.5)∶95nm。 2.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示殼聚糖納米粒能有效結(jié)合增強(qiáng)型綠
4、色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C<,1>。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不同比例結(jié)合(納米粒:質(zhì)粒)pEGFP-C<,1>質(zhì)粒的殼聚糖納米粒的包埋率分別為:100%(50∶10),100%(50∶25),100%(50∶50),(92±2.3)%(50∶75),(69±2.2)%(50∶100)。 3.納米粒體外釋放pDNA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示:殼聚糖納米粒釋藥包括較快釋放和平緩釋放兩個(gè)過(guò)程。在1-72h即釋藥達(dá)總量的(75.4±1.8)%,為較
5、快釋放過(guò)程。在72-168h釋放較為緩慢,釋藥達(dá)總量的(94.6±1.4)%為平緩釋放過(guò)程。 4.DNase Ⅰ消化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示:未加納米粒及按5∶50的比例加入納米粒處理的,在凝膠上無(wú)明顯的DNA條帶;而按50∶50,100∶50的比例處理的,均顯示明顯的DNA條帶,顯示殼聚糖納米粒在此種比例下有良好的DNA保護(hù)作用。 5.熒光顯微鏡檢測(cè)顯示:用連接上pEGFP-C<,1>質(zhì)粒的殼聚糖納米粒30ul去轉(zhuǎn)染時(shí)的轉(zhuǎn)染率(
6、58.6±2.6)%高于Lipofectamin的轉(zhuǎn)染率(45.5±2.5)%,經(jīng)統(tǒng)計(jì)有顯著性差異。 6.透射電鏡觀察顯示:以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導(dǎo)的端粒酶ASODN-t轉(zhuǎn)染的HepG-2細(xì)胞均有發(fā)生凋亡樣改變的細(xì)胞。 7.DNA抽提及電泳顯示:以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導(dǎo)的端粒酶ASODN-t轉(zhuǎn)染的HepG-2細(xì)胞均有凋亡帶。 8.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的結(jié)果顯示:殼聚糖納米
7、粒介導(dǎo)的的凋亡率大于Lipofectamin介導(dǎo)的凋亡率,有顯著差異。 9.對(duì)細(xì)胞抑制作用的觀察顯示:以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導(dǎo)的端粒酶ASODN-t轉(zhuǎn)染的HepG-2細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,其中以殼聚糖納米粒介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)更為緩慢,有顯著差異。 10.TRAP-ELISA法測(cè)定端粒酶活性的結(jié)果顯示:以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導(dǎo)的端粒酶ASODN-t轉(zhuǎn)染72h的HepG-2細(xì)胞的端粒酶活性
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