端粒酶抑制對肝癌細胞黏附和侵襲的影響.pdf

1、背景和目的:原發(fā)性肝癌主要是肝細胞癌,是一種惡性程度和病死率均較高的臨床常見腫瘤,其主要生物學特性是侵襲性強、易復發(fā)轉(zhuǎn)移、預后差。目前,手術(shù)、放療、化療等各種治療方法由于各自的局限性效果都不甚理想。因此,探索出新的有效的抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的方法具有重要的臨床意義。端粒酶是目前特異性較高、應用較廣的腫瘤標志物之一,端粒酶活性的高低不僅與細胞的增殖有關(guān),而且與惡性腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。端粒酶如何調(diào)節(jié)腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移,其機制尚不清楚。因此

2、,以端粒酶為靶點的腫瘤基因治療成為目前抗癌治療研究的熱點。本研究應用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體,將反義人端粒酶RNA基因?qū)肴烁伟┘毎礏EL-7402中,觀察肝癌細胞黏附和侵襲能力的變化及與肝癌細胞黏附和侵襲密切相關(guān)的蛋白的表達變化,從而探討反義人端粒酶RNA基因?qū)Ω伟┘毎礏EL-7402黏附和侵襲的作用及其作用的機制,為臨床肝癌的治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法:前期實驗成功構(gòu)建了攜帶正、反義人端粒酶RNA基因的真核表達質(zhì)粒PLXS

3、N-hTR,經(jīng)電穿孔將質(zhì)粒導入PT67包裝細胞及重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人肝癌細胞系BEL-7402等一系列過程,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的人肝癌細胞克隆。成功轉(zhuǎn)染正、反義端粒酶RNA基因的肝癌細胞分別為正義轉(zhuǎn)染組(BEL-7402-hTR-EeoRI)和反義轉(zhuǎn)染組(BEL-7402-hTR-BamHI),同時將未做任何處理的肝癌細胞BEL-7402作為空白對照組(BEL-7402)。三組細胞常規(guī)體外培養(yǎng),人工基底膜黏附實驗檢測細胞黏附能力的變化

4、,體外侵襲實驗檢測細胞侵襲能力的變化,免疫細胞化學檢測不同處理組細胞整合素β1(INTβ1)、上皮型鈣黏蛋白(E-cad)的表達水平,明膠酶譜法分析細胞MMP-2和MMP-9的活性變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.人工基底膜黏附實驗MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義轉(zhuǎn)染組、正義轉(zhuǎn)染組、空白對照組細胞的黏附率分別為48.75％、75.73％、79.50％,與空白對照組和正義轉(zhuǎn)染組相比,反義轉(zhuǎn)染組細胞的黏附能力明顯減低,正義轉(zhuǎn)染組和空白對

5、照組間黏附力無明顯差異。
　　 2.體外侵襲實驗結(jié)果顯示反義轉(zhuǎn)染組、正義轉(zhuǎn)染組、空白對照組細胞的穿膜細胞數(shù)分別為34.80±3.19、69.87±3.11、71.47±5.15,反義轉(zhuǎn)染組穿膜細胞數(shù)明顯少于正義轉(zhuǎn)染組和空白對照組,正義轉(zhuǎn)染組和空白對照組穿膜細胞數(shù)無明顯差異。
　　 3.免疫細胞化學圖像分析結(jié)果示,反義轉(zhuǎn)染組、正義轉(zhuǎn)染組、空白對照組細E-cad的表達水平分別為:0.2092±0.0196、0.1340±0.

6、0158、0.1244±0.0177,INTβ1的表達水平分別為:0.1533±0.0156、0.3747±0.0144、0.3846±0.0081,與空白對照組和正義轉(zhuǎn)染組相比,反義轉(zhuǎn)染組E-cad的表達水平明顯增強,INTβ1的表達水平明顯減低,正義轉(zhuǎn)染組與空白對照組相比,兩種蛋白的表達均無明顯差異。
　　 4.明膠酶譜法結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義轉(zhuǎn)染組細胞上清中MMP-9和MMP-2活性顯著低于正義轉(zhuǎn)染組和空白對照組,且各組細胞MMP-