原位保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD對(duì)牙骨質(zhì)再生的影響.pdf

1、背景和目的:
　　 牙周病治療的最終目標(biāo)是在控制牙周炎癥的基礎(chǔ)上完成牙周組織的重建。牙周再生一直是牙周領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，目前應(yīng)用于牙周再生的方法主要有:引導(dǎo)組織再生術(shù)(guided tissue regeneration，GTR)、骨材料移植、生長(zhǎng)因子的應(yīng)用以及近年來(lái)研究較多的組織工程技術(shù)。然而這些手段都不能實(shí)現(xiàn)牙周組織的完全再生，僅能不同程度地重建部分牙周附著，其中牙骨質(zhì)的再生顯得尤為困難，目前仍不能預(yù)測(cè)牙骨質(zhì)再生的數(shù)量和質(zhì)量。

2、
　　 牙骨質(zhì)是圍繞在牙根周?chē)囊槐拥V化結(jié)締組織，是牙周組織的重要組成部分。牙骨質(zhì)的最主要生理功能是為牙周膜纖維提供附著的錨點(diǎn)。牙骨質(zhì)中羥基磷灰石占50％，牙骨質(zhì)基質(zhì)占50％。由膠原蛋白和非膠原蛋白構(gòu)成。近些年的研究發(fā)現(xiàn)牙骨質(zhì)基質(zhì)中含有多種非膠原蛋白和生長(zhǎng)因子，如骨涎蛋白(bonesialoprotein，BSP)、骨橋素(osteopontin，OPN)、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、骨形態(tài)蛋白（bone mor

3、phogenetic protein，BMP-2，-3，-4）、血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子-α，β（platelet-derived growth factor-α andβ，PDGF-α andβ）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF-β）等，其獨(dú)特的細(xì)胞外基質(zhì)成分可能為牙骨質(zhì)的再生提供一個(gè)良好的微環(huán)境。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)經(jīng)EDTA處理的人健康的牙骨質(zhì)根片能夠誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞(human peri

4、odontal ligament cells，hPDLCs)向成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)牙骨質(zhì)新生。然而，這一結(jié)論是否同樣適用于牙周炎累及的病變牙骨質(zhì)呢？如果不能，是否有一些生長(zhǎng)因子能夠增強(qiáng)其促進(jìn)牙骨質(zhì)再生的作用呢？
　　 當(dāng)牙周炎癥破壞牙齦膠原纖維到達(dá)牙根表面時(shí)，牙骨質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分就遭到了破壞，稱(chēng)為病變牙骨質(zhì)。雖然有研究發(fā)現(xiàn)病變牙骨質(zhì)在去除牙石菌斑基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單拋光也能達(dá)到牙周健康，但近幾年一些學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)病變牙骨質(zhì)基質(zhì)

5、內(nèi)的一些非膠原蛋白成分發(fā)生了改變，如骨涎蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)、纖粘連蛋白(FN)等。這些成分的改變勢(shì)必影響了牙骨質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，這種病變牙骨質(zhì)是否仍有利于牙骨質(zhì)再生，目前鮮有報(bào)道。
　　 在眾多應(yīng)用于牙周再生的生長(zhǎng)因子中，釉基質(zhì)蛋白(enamel matrix proteins，EMPs)被公認(rèn)具有促進(jìn)牙骨質(zhì)再生的作用。EMPs是一組以釉原蛋白為優(yōu)勢(shì)的蛋白，它并不是單一的生長(zhǎng)因子，它的存在可能一定程度上模仿了牙

6、骨質(zhì)發(fā)育時(shí)期的情況。釉基質(zhì)衍生物（enamel matrix derivative，EMD）是經(jīng)過(guò)純化的釉基質(zhì)蛋白，其主要成分為釉原蛋白(amelogenin)，商品名為Emdogain，廣泛應(yīng)用于臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EMD能夠誘導(dǎo)形成無(wú)細(xì)胞外源纖維性牙骨質(zhì)。臨床對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用EMD比應(yīng)用屏障膜能夠獲得更多的臨床附著。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)EMD在體外能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞的生物學(xué)性能產(chǎn)生影響，并能誘導(dǎo)多種細(xì)胞，如牙周膜細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等

7、向成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化。但目前EMD在牙骨質(zhì)表面和牙本質(zhì)表面上的作用是否不同尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 因此，本研究的目的在于觀察原位保留的牙周炎病變牙骨質(zhì)是否能夠促進(jìn)牙骨質(zhì)再生，在保留牙骨質(zhì)的基礎(chǔ)上加入EMD是否能強(qiáng)化牙骨質(zhì)再生的效果。
　　 方法:
　　 1.原位保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD對(duì)人牙周膜細(xì)胞成牙骨質(zhì)分化的研究
　　 1.1病變牙骨質(zhì)原位保留對(duì)人牙周膜細(xì)胞成牙骨質(zhì)分化影響的體外研究
　

8、　 收集因牙周炎Ⅲ度松動(dòng)而拔除的前牙和前磨牙48顆，并沿牙齦邊緣和牙周袋底做標(biāo)記。沿標(biāo)記截取中間部分，EMS超聲器械去除根面牙石菌斑后縱裂為對(duì)稱(chēng)的兩片，一片用刮治器去除根面牙骨質(zhì)，暴露根面牙本質(zhì)（dentin，D組），另一片保留牙骨質(zhì)（cementum，C組）。所有根片經(jīng)24％EDTA凝膠酸蝕2min后于20萬(wàn)U/ml青霉素鏈霉素溶液4℃浸泡48h，無(wú)菌PBS沖洗后備用。收集因正畸需要拔除的前磨牙的牙周膜，組織塊法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞

9、，胰酶消化，收集第二代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。C組和D組各取24片置于48孑板內(nèi)，第二代牙周膜細(xì)胞以1x106/ml的濃度接種到根片表面，共培養(yǎng)7天后，每組取四片進(jìn)行掃描電鏡觀察，每組剩余20片分別用微量RNA提取試劑盒提取總RNA，熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)兩組牙骨質(zhì)附著蛋白(cementum attachment protein，CAP)和牙骨質(zhì)蛋白-23（cementum protein-23，CP-23）的mRNA表達(dá)量。
　

10、　 1.2原位保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD對(duì)人牙周膜細(xì)胞體內(nèi)形成牙骨質(zhì)的影響
　　 牙本質(zhì)組和牙骨質(zhì)組根片各取24片置于48孔板內(nèi)，第二代牙周膜細(xì)胞以1×106個(gè)/ml的濃度接種到根片表面，按照重懸液的不同，將兩組根片分為四組:牙骨質(zhì)片滴加DMEM培養(yǎng)液為C組，牙骨質(zhì)片滴加EMD培養(yǎng)液為E+C組，牙本質(zhì)片滴加DMEM培養(yǎng)液為D組，牙本質(zhì)片滴加EMD培養(yǎng)液為E+D組。每三天換液一次，共培養(yǎng)至第七天時(shí)，用聚四氟乙烯膜包裹根片，植入

11、裸鼠背部皮下，每只裸鼠共植入四片，每組一片。三周后處死裸鼠取出根片，10％EDTA液脫鈣后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、5μm切片、HE染色，觀察四組標(biāo)本新生組織的形成情況，對(duì)有牙骨質(zhì)類(lèi)似物形成的標(biāo)本進(jìn)行BSP的免疫組化染色觀察。
　　 2.原位保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD在Ⅲ度根分叉病變牙骨質(zhì)再生及新附著形成中的作用
　　 選取雄性比格犬八只，雙側(cè)下頜第三第四前磨牙(P3P4)作為實(shí)驗(yàn)牙位。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日前四周，在實(shí)驗(yàn)牙位制作高度為5m

12、m的Ⅲ度根分叉骨缺損并置入含有牙周混合菌的棉球2周，以建立Ⅲ度根分叉病變模型。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日前2周將棉球取出，并對(duì)實(shí)驗(yàn)牙位進(jìn)行齦下刮治以去除菌斑牙石。此后每天用氯己定溶液進(jìn)行口腔衛(wèi)生護(hù)理。手術(shù)當(dāng)天，未見(jiàn)明顯炎癥和牙齦退縮，每只比格犬的雙側(cè)P3P4按隨機(jī)原則接受下列處理方法中的一種:
　　 C:保留病變牙骨質(zhì)+EDTA酸蝕2min;
　　 D:刮除病變牙骨質(zhì)+EDTA酸蝕2min;
　　 E+C:保留病變牙骨質(zhì)+EDTA

13、酸蝕2min+EMD凝膠;
　　 E+D:刮除病變牙骨質(zhì)+ EDTA酸蝕2min+EMD凝膠。
　　 各組均在全麻下頰側(cè)翻瓣，刮除肉芽組織，并按實(shí)驗(yàn)要求處理相關(guān)根面，并于根分叉入口覆蓋海奧膠原膜。基于本實(shí)驗(yàn)的目的和實(shí)驗(yàn)操作方便的考慮，操作過(guò)程中未給以舌側(cè)翻瓣。術(shù)后八周4％多聚甲醛灌注法處死動(dòng)物，取出標(biāo)本，每組共獲8個(gè)標(biāo)本，每組取2個(gè)標(biāo)本進(jìn)行硬組織包埋處理，切片，甲苯胺藍(lán)染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察。每組剩余6個(gè)標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)脫鈣，

14、石蠟包埋，5μm切片，HE染色，進(jìn)行新生組織的觀察和測(cè)量。
　　 結(jié)果:
　　 1.根面保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD對(duì)人牙周膜細(xì)胞成牙骨質(zhì)分化的研究
　　 1.1病變牙骨質(zhì)原位保留對(duì)人牙周膜細(xì)胞成牙骨質(zhì)分化影響的體外研究
　　 牙周膜組織塊貼壁7～10天左右，倒置顯微鏡下可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞從組織塊周邊游出，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)瓶底80％時(shí)可進(jìn)行傳代。傳代后的細(xì)胞經(jīng)免疫染色顯示波形絲蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白染色陰性，證明培養(yǎng)

15、的細(xì)胞是中胚層來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞且無(wú)外胚層來(lái)源的細(xì)胞污染。第二代牙周膜細(xì)胞接種于兩組根片后的掃描電鏡顯示:兩組根片上細(xì)胞生長(zhǎng)良好，牙本質(zhì)片上細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，牙骨質(zhì)片上細(xì)胞略大，長(zhǎng)梭形態(tài)不明顯。熒光實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示:牙骨質(zhì)組（C組）CAP mRNA表達(dá)量顯著高于牙本質(zhì)組（D組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）;C組CP-23mRNA表達(dá)量顯著高于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。
　　 1.2原位保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合

16、應(yīng)用EMD對(duì)人牙周膜細(xì)胞體內(nèi)形成牙骨質(zhì)的影響
　　 裸鼠植入根片后，活動(dòng)良好，未出現(xiàn)飲食異常。術(shù)后一周拆線，除一只裸鼠的左上傷口縫線已開(kāi)，根片脫離外，其余傷口均愈合良好。聚四氟乙烯膜包繞根片位于裸鼠皮下，無(wú)感染，無(wú)暴露。三周時(shí)取材，D、E+C、E+D三組均獲得12個(gè)標(biāo)本，C組獲得11個(gè)標(biāo)本。HE染色結(jié)果顯示:D組與E+D組均無(wú)牙骨質(zhì)類(lèi)似物形成，新生物均為疏松的纖維結(jié)締組織;C組有7個(gè)標(biāo)本表現(xiàn)為新生牙骨質(zhì)類(lèi)似物形成，E+C組有10

17、個(gè)標(biāo)本表現(xiàn)為新生牙骨質(zhì)類(lèi)似物形成，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。BSP染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的新生牙骨質(zhì)類(lèi)似物均對(duì)BSP染色陽(yáng)性。
　　 3.原位保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD在Ⅲ度根分叉病變牙骨質(zhì)再生及新附著形成中的作用
　　 我們成功建立了32顆比格犬下頜前磨牙的Ⅲ度根分叉病變模型。術(shù)后八周，所有牙位愈合良好，無(wú)明顯感染或牙齦退縮。組織學(xué)測(cè)量結(jié)果顯示，新生牙骨質(zhì)百分比:C組顯著高于D組，而E+C組和E+D組顯著高于

18、C組，E+C組和E+D組組間差異不顯著。新生骨百分比:C組顯著高于D組，而E+C組和E+D組顯著高于C組，E+C組和E+D組組間差異不顯著。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，D組新生牙周膜纖維稀疏，無(wú)主纖維束，與新生牙骨質(zhì)和牙槽骨平行排列或排列混亂，未插入其中形成良好的新附著;C組新生牙骨質(zhì)沉積在原有牙骨質(zhì)表面，牙周膜纖維排列整齊，且有主纖維束分別插入新生牙槽骨和牙骨質(zhì)中，形成新附著;E+D組與E+C組新生牙骨質(zhì)數(shù)量多，牙周膜纖維粗大，大多建立了良好的新