凋亡相關(guān)蛋白POTE在晚期非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥中的功能研究.pdf

1、研究背景：
　　肺癌是目前全球發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一。在我國，肺癌的發(fā)病率在逐年上升，并且已經(jīng)成為我國城市人口癌癥死亡的主要原因。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要病理類型，占80%左右。由于早期肺癌缺乏特異性癥狀，65%-70%的NSCLC患者確診時已處于晚期，失去手術(shù)治療的機(jī)會。晚期肺癌治療一般采取多學(xué)科綜合治療，其中化療是最重要手段之一。自80年代以來，隨

2、著第三代化療藥物不斷涌現(xiàn)，以鉑類為基礎(chǔ)聯(lián)合第三代化療新藥的方案成為晚期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)化療(Standard Chemotherapy, SC)方案，但其化療的有效率(Response Rate, RR)僅為30%-40%，NSCLC的5年生存率僅為15%。而造成化療失敗的主要原因是耐藥。
　　一直以來，順鉑被認(rèn)為是晚期NSCLC化療的基石，幾乎所有一線NSCLC化療方案都是與順鉑聯(lián)合應(yīng)用的方案。順鉑的抗癌作用機(jī)制是藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)

3、胞后，與DNA交叉連接，形成穩(wěn)定的順鉑-DNA復(fù)合物，阻斷DNA復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。當(dāng)前認(rèn)為導(dǎo)致順鉑耐藥的機(jī)制包括腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低、藥物在細(xì)胞內(nèi)被降解代謝以及DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)。除此之外，還包括凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變。順鉑抗腫瘤作用的主要機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生改變主要由于細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，凋亡相關(guān)因子表達(dá)異常引起。
　　POTE基因家族是靈長類生物所特有的，包含13個高度同源的基

4、因亞型，分別位于8條不同的染色體上。在多種腫瘤組織（前列腺癌，結(jié)腸癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌和胰腺癌）及生殖細(xì)胞中表達(dá)，但在正常組織中不表達(dá)。在腫瘤組織中高表達(dá)的主要亞型是POTE-2γ和POTE-2α。目前POTE的功能尚不明確。有研究在Hela細(xì)胞及精子細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，POTE可能與Fas/FasL、BAK、Casepase-3等凋亡相關(guān)蛋白相互作用，與凋亡信號相關(guān)。本實驗室前期運用二維凝膠電泳及質(zhì)譜分析的方法，在A549（人肺腺癌細(xì)胞珠

5、）和A549/DDP（順鉑誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株）中分析差異性蛋白時發(fā)現(xiàn)：POTE蛋白在A549/DDP細(xì)胞株中表達(dá)明顯低于A549細(xì)胞。本研究旨在篩選出在A549細(xì)胞中起主導(dǎo)作用的POTE亞型，并分析其在A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)差異。收集應(yīng)用含鉑雙藥治療的臨床樣本（腫瘤組織），初步分析POTE表達(dá)變化與NSCLC患者化療療效之間的關(guān)系。本研究共分三部分進(jìn)行：
　　第一部分:A549/DDP耐藥株建立及生物學(xué)行為鑒定<

6、br>　　【目的】
　　A549細(xì)胞株基礎(chǔ)上誘導(dǎo)的A549/DDP細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)行為的鑒定。
　　【方法】
　　采用順鉑敏感人肺腺癌細(xì)胞株A549經(jīng)順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生對順鉑耐藥的耐藥細(xì)胞株A549/DDP；MTT法檢測兩細(xì)胞株對順鉑的敏感性。
　　1.人肺腺癌敏感細(xì)胞株A549順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥的細(xì)胞株A549/DDP。
　　2. MMT法檢測結(jié)果顯示順鉑對A549和A549/DDP細(xì)胞的增殖均有抑制作用，

7、順鉑對A549和A549/DDP細(xì)胞的IC50值分別為5.6和42.6ug/ml，耐藥倍數(shù)為7.57倍。
　　【結(jié)論】
　　成功獲得了人非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP，明確耐藥細(xì)胞株的耐藥指數(shù)為7.57倍。
　　第二部分:POTE蛋白在A549細(xì)胞中主要的表達(dá)亞型及其在鉑類耐藥中的作用和機(jī)制
　　【目的】
　　本部分實驗旨在篩選出A549細(xì)胞中POTE主要表達(dá)的亞型，明確其在A549和A549/DD

8、P細(xì)胞中分子水平和蛋白水平的表達(dá)差異，探討POTE-2γ與凋亡相關(guān)因子（Fas、Bax、Bak、Caspase-3）的關(guān)系。
　　【材料和方法】
　　1.運用Trizol提取A549細(xì)胞中的總RNA；
　　2.運用PCR產(chǎn)物克隆篩選的方法，篩選出62個菌落測序；
　　3.運用DNAstar軟件進(jìn)行堿基比對；
　　4.應(yīng)用蛋白印跡法(Western Blot, WB)驗證POTE-2γ在A549和A549/D

9、DP細(xì)胞中的表達(dá)差異；
　　5.運用蛋白印跡的方法分別檢測順鉑在不同時間和濃度梯度時，A549及A549/DDP兩細(xì)胞株中POTE-2γ及凋亡相關(guān)因子（Fas、Bax、Bak、Caspase-3）表達(dá)量的變化；
　　6.構(gòu)建慢病毒載體,感染 A549細(xì)胞，下調(diào)POTE-2γ表達(dá)，蛋白印跡檢測目標(biāo)蛋白（Fas、Bax、Bak）表達(dá)變化。
　　【結(jié)果】
　　1.PCR克隆篩選出的62個菌落中，其中4個測序失敗，58個

10、完成測序。完成測序的58個序列通過堿基比對均為POTE-2γ。
　　2.慢病毒對A549細(xì)胞中POTE-2γ表達(dá)量的干擾效率約73.6%。
　　3.蛋白印跡法及免疫細(xì)胞化學(xué)驗證結(jié)果顯示POTE-2γ在A549及A549/DDP兩細(xì)胞株間存在表達(dá)差異。
　　4.蛋白印跡結(jié)果顯示順鉑在不同時間和濃度梯度 POTE-2γ在 A549及 A549/DDP兩細(xì)胞株間存在表達(dá)差異。
　　5.在 A549細(xì)胞中下調(diào) POTE-

11、2γ的表達(dá)，凋亡相關(guān)蛋白（Fas、Bax、Bak）表達(dá)的表達(dá)量也相應(yīng)下調(diào)。
　　【結(jié)論】
　　1.在A549細(xì)胞中主要表達(dá)的POTE亞型是POTE-2γ。
　　2. POTE-2γ在A549細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于A549/DDP細(xì)胞。
　　3. POTE-2γ可能通過上調(diào)Fas等促凋亡因子，下調(diào)Bax，Bak等抗凋亡受體發(fā)揮促凋亡作用，而與順鉑耐藥相關(guān)。
　　第三部分:NSCLC患者組織中POTE-2γ表達(dá)

12、水平與含鉑雙藥化療療效的相關(guān)性
　　【目的】探討POTE-2γ表達(dá)與晚期NSCLC患者一線使用含鉑雙藥方案治療的療效的關(guān)系。
　　【材料和方法】
　　1.收集接受一線含鉑雙藥治療的晚期NSCLC患者的腫瘤組織；
　　2.采用Trizol法提取組織中的總RNA；
　　3.采用Fermentas RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄；
　　4.采用實時熒光

13、定量PCR檢測組織中POTE-2γ的表達(dá)量；
　　5.運用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)。
　　【結(jié)果】
　　1. POTE-2γ高表達(dá)的患者一線使用含鉑雙藥方案的療效優(yōu)于低表達(dá)者，且與患者的性別相關(guān)（P=0.003）；
　　2. POTE-2γ高表達(dá)的患者TTP（Time To Progress）和OS（Over Servival）均長于POTE-2γ低表達(dá)的患者。
　　【結(jié)論】
　　POTE-2γ可能可以作