抗結核藥物緩釋微球在兔椎體中釋放及分布規(guī)律的研究.pdf

1、研究背景:據世界衛(wèi)生組織的統計到目前為止結核病仍然是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，目前全球有約1/3的人口被感染結核分枝桿菌。目前全世界結核病患者逾2000萬，每年新增近800萬，1993年WHO宣布了“全球進入結核病緊急狀態(tài)”。據文獻報道在HIV陰性的患者約有3％-5％的患者在感染肺結核后出現脊柱結核，而HIV陽性患者這一數字則達到了60％，這向廣大醫(yī)務工作者和骨科工作者敲響了警鐘和提出了新的要求。我國1979年全國第一次結核病流

2、行病學調查結果顯示，活動性肺結核患病率717/10萬，全國約有活動性肺結核病人700萬，據專家估計骨與關節(jié)結核占3％-5％，即有骨關節(jié)結核病人21萬-35萬。2000年全國第四次結核病流行病學調查結果，活動性肺結核患病率367/10萬。估計全國有活動性肺結核病人500萬，如按3％-5％計算，現有骨關節(jié)結核病人15-25萬。外科手術可以直接切除脊柱結核病灶，但不能完全清除結核菌。而手術放置內固定則有可能成為術區(qū)殘留結核菌粘附的金屬床，加上

3、骨骼特殊的成分和生理活性，以及抗結核藥物自身半衰期較短和組織滲透性差的特點，治療藥物按一般給藥途徑難以有效轉運到作用部位，成為了脊柱結核術后復發(fā)的一個重要原因。在脊柱結核外科手術結束時往往會在術區(qū)局部放置抗結核藥物，但是局部的藥物會隨血液循環(huán)和自身的代謝迅速消失。聚乳酸(PLA)已經廣泛應用于載藥釋放系統的實驗研究，其中外消旋聚乳酸(D，L-polylactic-acid，PDLLA)是經FDA批準可用作醫(yī)用手術防粘連膜和注射用微膠囊、

4、微球及埋植劑等緩釋制劑的材料。羥基磷灰石(簡稱HA)，分子式為Ca10(PO4)6(OH)2，其組成和結構均與人體硬組織（骨骼，牙齒）中的無機成份相似，具有優(yōu)良的生物相容性和生物活性，植入人體后能與原骨組織形成生理結合。因此本題提出了設計了兩種組織相容性好，緩釋效果理想的抗結核藥緩釋載體，通過在術區(qū)埋置抗結核藥物緩釋劑，使骨骼中的抗結核藥物濃度長期保持在有效殺菌藥物濃度，并對緩釋劑的離體釋放和在動物椎骨中釋放進行濃度檢測。從而有效地提高

5、脊柱結核的療效，減少脊柱結核術后的復發(fā)，為骨結核的治療提供理論依據和治療手段。
　　 本文對實驗動物脊柱骨內埋置抗結核藥物緩釋劑后外周血液持續(xù)給予五聯抗癆藥物，采用液相-質譜聯用技術(HPLC-MS)又叫液相色譜-質譜聯用技術對藥物濃度進行檢測（它以液相色譜作為分離系統，質譜為檢測系統）。對實驗動物椎骨及外周血液中異煙肼(INH)，利福平(RFP)和吡嗪酰胺(PZA)，鏈霉素(MS)及乙胺丁醇(EMB)五種一線抗結核藥物的濃度進

6、行了全面檢測。探討正規(guī)化療及埋置緩釋劑后抗結核藥物在實驗動物脊柱骨中的分布情況，為探索進一步提高脊柱結核病灶清除術的患者術區(qū)抗結核藥物濃度提供理論依據。
　　 目的:
　　 1.尋找一種能夠在脊柱結核病灶術區(qū)內持續(xù)長時間釋放抗結核藥物的緩釋載體，保障術區(qū)保持長期的有效殺菌濃度。
　　 2.尋找出一種一次性進樣檢測全部一線五種抗結核藥物濃度的檢測方法，并確保該方法檢測結果符合生物樣本濃度檢測的要求。
　　

7、3.對實驗動物進行造模干預后模擬人體抗結核治療的過程，檢測其病灶內的藥物濃度并與人體抗癆治療后藥物濃度作比較，將異煙肼緩釋微球放入實驗動物病灶中進行濃度檢測了解其代謝和分布規(guī)律。
　　 方法:
　　 1.尋找出一種能夠在脊柱結核病灶術區(qū)內持續(xù)長時間釋放抗結核藥物的緩釋載體
　　 (1)采用復乳-溶媒揮發(fā)法制備異煙肼聚乳酸微球
　　 ①分別稱量聚乙烯醇4 g和1 g加入超純水各100ml，加熱至100(℃)

8、后充分攪拌溶解聚乙烯醇為4％和1％ PVC液各100ml備用。
　　 ②稱量INH標準品20 mg，溶于4％ PVC液1 ml中;稱量PLGA25 mg溶于2 ml二氯甲烷中。
　　 ③將含INH的4％ PVC液體倒入二氯甲烷溶液中，冰水沖浴下磁力攪拌，分散1 min，形成W/O液(water/oil)。
　　 ④倒入1％ PVC液10ml，攪拌10 min，形成W/O/W。將W/O/W倒入1％PVC20 ml中

9、攪拌12-18 h，擴散有機相。
　　 ⑤將全部液體高速離心4000轉/min離心10 min得漂浮白色顆粒，將白色顆粒用BPS液體沖洗后再次離心，收集離心后的BPS液體測試紫外，取頂部白色漂浮物再次BPS液沖洗，離心，循環(huán)三次后用稱量紙包裹白色顆粒晾曬干燥后備用。
　　 (2)采用壓力滲透技術備制羥基磷灰石異煙肼微球
　　 ①稱取質量比為10∶10∶80的Li2CO3，CaCO3，H3BO3粉料充分混合。

10、>　　 ②混合物置于硅碳棒高溫爐中，在1100℃下加熱熔融15 min后冰水急速淬冷。
　　 ③將混合物干燥破碎后篩取100-140目（每平方英時篩網上的孔眼數目）之間的顆粒，再至于800℃管式爐中球化兩次。
　　 ④將球化后的顆粒置于K2HPO4(0.25 mol/L，pH=9)溶液中，靜置于37℃恒溫箱中一周后取出。
　　 ⑤用去離子水充分洗滌后再90℃恒溫干燥24 h，然后將微球置于800℃馬弗爐中加熱2

11、h，冷卻后即得到多孔HA微球。
　　 ⑥稱量異煙肼標準品23.4 mg加入超純水1ml，超聲10 min后加溫至90(℃)充分溶解藥物備用。
　　 ⑦稱量制備好的羥基磷灰石0.100 g放入50 ml燒杯，再放入真空干燥箱中保持真空度＜0.058 MPa放置12h，以排除微球孔隙中的氣體增加載藥量，異煙肼藥液倒入微球超聲15 min，放置24 h。
　　 ⑧將全部液體高速離心4000轉/min離心10 min將上

12、清液收集測試紫外。取底部白色沉淀再次BPS液沖洗，離心，循環(huán)三次后用稱量紙包裹白色顆粒晾曬干燥后備用。
　　 2.尋找出能一次性進樣檢測全部一線五種抗結核藥物濃度的檢測方法，并確保該方法檢測結果符合生物樣本濃度檢測的要求。
　　 (1)確定出檢測的HPLC-MS條件
　　 ①色譜柱:親水性高效液相色譜(HILIC)柱(150mm×2.1 mmI.D.，3μm(Thermo，USA)。柱前連接有一個RRLC在線過濾

13、器(Agilent, Germany)。柱溫:40(℃)。
　　 ②流動相:由甲醇和含0.1％甲酸的5mM乙酸銨溶液(65∶35，v/v)組成。流速:0.5 mL/min。進樣量:5μL。
　　 ③質譜離子化方式:正離子電噴霧離子化(ESI+)。采用多級反應離子監(jiān)測(MRM)模式進行定量，相應的MRM離子對和質譜參數為。ESI+條件:噴霧電壓5000V;離子源溫度700℃;氣簾氣15 psi，碰撞活化參數:M;霧化氣:7

14、0psi;輔助氣:65 psi。
　　 (2)樣品提取過程
　　 ①樣品提取溶液:含5mM乙酸銨、0.1％甲酸和10％水的甲醇溶液。
　　 ②100μl標準曲線系列樣品或質控樣品加50μl內標工作液和300μl樣品提取溶劑。待測血漿樣品100μl，加50μL內標工作液和300μl樣品提取溶劑。
　　 ③樣品經充分渦旋2 min后，于13000rpm離心10 min。上清液轉移至自動進樣瓶中，進樣5μl。<

15、br>　　 (3)建立標準曲線
　　 得出9個濃度低度的色譜圖，再以五種藥物的峰面積為X軸、三種藥物的濃度為Y軸作線性性分析。
　　 RPZA=0.9982, RINH=0.9973,RSM=0.9963, REMB=0.9921, RRFP=0.9973
　　 YPZA=0.000377x+0.00577
　　 YINH=0.000654x+0.00384
　　 YSM=8.7e-005x-0

16、.000435
　　 YEMB=0.104x+0.0596
　　 YRFP=0.00137x+0.00199
　　 (4)樣品處理
　　 ①取樣品血漿100μl，加內標液50μl，加提取液300μl（流動相/甲醇=65∶35），渦旋15 min后離心10 min取上清液進樣。
　　 ②骨組織樣品則加入200μl骨組織提取液，加內標液50μl，加提取液300μl（流動相/甲醇=65∶35），渦旋15

17、 min后離心10min取上清液進樣。
　　 ③得5種抗結核藥物和2中內標藥物質譜圖，帶入標準曲線求出藥物濃度。
　　 3.對實驗動物進行造模干預，模擬人體結核抗癆治療的過程，為脊柱結核的基礎研究搭建實驗動物平臺。
　　 (1)實驗動物的準備
　　 ①新西蘭白兔（成年2-3歲）共38只（清潔級），雌雄不限。飼養(yǎng)條件為:23℃左右，相對濕度:70％左右，標準兔飼料飼養(yǎng)2周（基本熱量需求）。
　　 ②

18、提前一個月對新西蘭兔予以地塞米松注射液(Dexamethasone，DSMS)0.32 mg iv QOD（按照0.16 mg/公斤折算），一周后改為片劑喂飼給藥0.06 mg poQD（按照0.03 mg/公斤折算），抑制其體液免疫和細胞免疫。
　　 (2)菌株備制過程
　　 ①將牛型結核分枝桿菌減毒菌株BCG在改良Sauton液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴增2～3周。
　　 ②分裝于離心管，離心后用10％小牛血清培養(yǎng)液稀

19、釋成均勻的5mg/ml混懸液，常溫放置待用。使用時再次稀釋并鏡下調整濃度為1×105/ml。
　　 (3)菌株接種過程。
　　 ①麻醉滿意后常規(guī)碘酒消毒，酒精脫碘，鋪無菌巾，術前器械高溫消毒，取雙側第12肋末端連線的中點向下至雙側髂嵴連線的中點作約4 cm縱向切口的后正中入路，顯露腰4、5椎體棘突及棘上韌帶。
　　 ②于腰5椎體左側近椎間盤處緊貼椎體皮質骨部由上往下剝離，暴露腰5椎體的左半部。用電動球磨鉆機在腰5

20、椎體上鉆一骨孔，深度約為0.4 cm、孔徑約0.25 cm，骨孔道止血后填入醫(yī)用明膠海綿，在明膠海綿上用注射器緩慢注射BCG菌株懸液0.1 ml。
　　 ③1-0號絲線間斷關閉切口，關閉深筋膜后皮下涂灑注射用青霉素粉劑(30萬U/只)，縫合皮膚后再次酒精消毒，無菌紗布覆蓋切口上，并固定好。
　　 ④將動物松綁后送入3P級飼養(yǎng)房內飼養(yǎng)。
　　 結果:
　　 1.制作一種能夠在脊柱結核病灶術區(qū)內持續(xù)長時間釋放

21、抗結核藥物的緩釋載體，保障術區(qū)保持長期的有效殺菌濃度。
　　 ①聚乳酸異煙肼微球孔隙率為63.68％，羥基磷灰石異煙肼微球孔隙率為82.18％。
　　 ②聚乳酸異煙肼微球載藥率為26.62％，包封率為28.35％。羥基磷灰石異煙肼微球載藥率為10.45％，包封率39.87％。
　　 ③兩種緩釋微球均能在第52天釋放出有效殺菌濃度的異煙肼。
　　 2.尋找出一種一次性進樣檢測全部一線五種抗結核藥物濃度的檢測

22、方法，并確保該方法檢測結果符合生物樣本濃度檢測的要求。
　　 ①本題所采用的質譜條件下可以一次性進樣品檢測出全部五種一線抗結核藥物濃度，檢測時間控制在3分鐘以內，效率比單純的液相色譜技術進行檢測大大提高。
　　 ②INH，RFP，PZA，SM和EMB回收率:分別為98.1％，97.6％，98.3％，98.1％和97.9％。日間及夜間變異率:在5.6％-12.3％。INH，RFP，PZA，SM，和EMB。精密度:分別為0.

23、212％，0.119％，0.103％，0.351％和0.209％。
　　 3.對實驗動物進行造模干預后模擬人體抗結核治療的過程，檢測其病灶內的藥物濃度并與人體抗癆治療后藥物濃度作比較，將異煙肼緩釋微球放入實驗動物病灶中進行濃度檢測。
　　 ①采用牛型結核分枝桿菌減毒菌株BCG造模的實驗動物，病灶組織學改變同H37R(V)菌株存在很大差異，但形態(tài)學改變上有一定的相似性。
　　 ②實驗動物病灶內的抗結核藥物濃度與人體

24、脊柱結核病灶內藥物濃度有一定差異。實驗動物服藥后抗結核藥物原藥的濃度在髂骨和病灶中較為相似，在血液中存在少許差異。（2小時FRFP血=8.544，PRFP血=0.015，3小時FRFP血=6.182PRFP血0.040）而其代謝產物的差異則更為明顯。
　　 ③在實驗動物體內埋置異煙肼緩釋微球，能有效的長期保持局部抗結核藥物的高濃度水平。
　　 結論:
　　 1.聚乳酸和羥基磷灰石異煙肼微球能在術區(qū)內緩慢釋放，長期