CYP3A29基因在豬支原體肺炎發(fā)生過(guò)程中的作用研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450酶(CYP)是一種能夠氧化多種底物的血紅素硫氫酸鹽類(lèi)酶，在類(lèi)固醇類(lèi)物質(zhì)合成、前致癌劑激活、藥物代謝等方面發(fā)揮重要作用，最新研究表明細(xì)胞色素P450酶也參與炎癥反應(yīng)。CYP3A29是豬CYP3A亞家族的主要功能酶。豬支原體肺炎是由肺炎支原體引起的一種慢性呼吸道傳染病，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)豬CYP3A29基因表達(dá)與肺炎支原體感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。
　　目的:通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CYP3A29基因的豬肺泡巨噬細(xì)胞系，探

2、討CYP3A29基因在肺炎支原體感染炎癥反應(yīng)過(guò)程的作用。
　　方法:RT-PCR獲取豬CYP3A29基因序列，目的片段與pMD18-T相連，得到pMD18-T-CYP3A29重組質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，用XhoⅠ和NotⅠ對(duì)重組質(zhì)粒及pcDNA3.1(+)/zeo進(jìn)行雙酶切，分別獲取線(xiàn)性DNA片段，用T4 DNA連接酶將二者連接，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/zeo-CYP3A29，并對(duì)其進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，擴(kuò)增陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)

3、粒，并以脂質(zhì)體2000將其轉(zhuǎn)染至豬肺泡巨噬細(xì)胞系3D4/21，zeocin抗性篩選后，RT-PCR及Wesrern-blot鑒定基因表達(dá)。豬肺炎支原體感染不同處理組細(xì)胞，檢測(cè)炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PPAR-γ受體基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　1、克隆獲取豬CYP3A29基因序列，經(jīng)與NCBI上相應(yīng)序列比對(duì)分析，同源性達(dá)99％。
　　2、成功構(gòu)建CYP3A29基因真核表達(dá)載體。
　　

4、3、zeocin濃度分別為50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml的完全細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，300μg/ml組、250μg/ml組細(xì)胞分別在第5天和第7天全部死亡，200μg/ml組細(xì)胞在第11天全部死亡，此時(shí)150μg/ml組還有細(xì)胞存活。
　　4、24孔板培養(yǎng)的細(xì)胞，以125ng/孔、250ng/孔、375ng/孔、500ng/孔四種不同濃度的重組DNA轉(zhuǎn)染，50

5、0ng/孔組轉(zhuǎn)染效果最好。
　　5、轉(zhuǎn)染篩選到的細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)到目的條帶、western-blot檢測(cè)到CYP3A29的表達(dá)。
　　6、Mhp刺激不同處理組PAM均能引起相關(guān)炎性因子表達(dá)上調(diào)，其中CYP3A29基因過(guò)表達(dá)組細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)量出現(xiàn)極顯著上調(diào)(P＜0.01)分別出現(xiàn)在4h、8h、4h、8h，正常組細(xì)胞和空載組細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)量極顯著上調(diào)(

6、P＜0.01)分別出現(xiàn)在18h、12h、12h、12h（空載組細(xì)胞未見(jiàn)極顯著上調(diào)）;在Mhp刺激相同時(shí)間時(shí)，CYP3A29基因過(guò)表達(dá)組細(xì)胞與正常組和空載組細(xì)胞相比較IL-1β的表達(dá)量在4h、8h差異極顯著(P＜0.01)，12h時(shí)差異顯著(P＜0.05)，IL-6的表達(dá)量在8h時(shí)差異顯著(P＜0.05)，IL-8的表達(dá)量在4h時(shí)差異極顯著(P＜0.01)，8h、18h時(shí)差異顯著(P＜0.05)，TNF-α的表達(dá)量在8h、12h、18h時(shí)

7、差異極顯著(P＜0.01)。
　　7、Mhp刺激后，不同處理組細(xì)胞PPAR-γ的表達(dá)量在18h時(shí)出現(xiàn)短暫上調(diào)，且各個(gè)時(shí)間段檢測(cè)結(jié)果表明CYP3A29基因過(guò)表達(dá)組細(xì)胞PPAR-γ的表達(dá)量均顯著低于正常組和空載組細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1、獲得了能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的CYP3A29基因CDS區(qū)片段，成功構(gòu)建了含有CYP3A29基因的真核表達(dá)載體。
　　2、優(yōu)化了細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系及轉(zhuǎn)染過(guò)程中的藥物篩選濃度;成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)C